Implantação da plataforma CRISPR/Cas9 em micobactérias para o desenvolvimento de novas vacinas e diagnósticos. - Moraes, Luana (2024)
A tuberculose (TB) é um sério problema de saúde pública mundial, e gera grandes impactos na economia pecuária de bovinos (bTB). Em humanos, o principal agente etiológico é o Mycobacterium tuberculosis (Mtb) e em bovinos, o M. bovis (Mb). A única vacina atualmente licenciada contra a TB é a BCG, uma vacina viva atenuada de Mb que é altamente eficaz na proteção contra as formas severas da TB em crianças, sendo a vacina mais amplamente usada no mundo. No entanto, a proteção contra a tuberculose pulmonar em adultos é muito variável e, em bovinos, não é aplicável pela baixa eficiência somada ao risco de interferir nos testes diagnósticos usados no controle da bTB. A ferramenta de edição genética, CRISPR/Cas9 é uma ferramenta biotecnológica de edição de genomas que foi vastamente aplicada em diversos organismos com bastante sucesso e pode ser uma alternativa para o melhoramento da própria BCG (BCG recombinante - rBCG). Com isso, propusemos o estabelecimento da ferramenta CRISPR/Cas9 em BCG visando o desenvolvimento de uma vacina contra tuberculose e sua compatibilidade com testes diagnósticos para viabilizar o uso em bovinos. Para tal, vetores micobacterianos contendo o sistema CRISPR/Cas9 foram gerados. Quando utilizados para a deleção do gene lysA, observamos eficiências na geração de mutações em 25 e 5% para M. smegmatis e BCG, respectivamente. O BCG mutante para lysA (ΔlysA) serviu como plataforma para expressão do adjuvante LTAK63 (uma versão da subunidade A da toxina LT de E. coli detoxificada geneticamente), e foi denominado rBCGΔLTAK63. Camundongos imunizados com rBCGΔLTAK63 apresentaram maior proteção contra a infecção por Mtb e melhor resolução do quadro inflamatório nos pulmões. Quando aplicamos a ferramenta para deleção de genes mpb70, mpb83, espA, espC e esxS em BCG, envolvidos no diagnóstico para diferenciar animais infectados dos vacinados (DIVA), obtivemos sucesso de mutações em quatro dos cinco genes com eficiências de: mpb70 = 75%, mpb83 = 20%, espC = 4,3% e esxS = 15,7%. Este estudo demonstra o estabelecimento e aplicação eficaz da tecnologia CRISPR/Cas9 em BCG visando o desenvolvimento de uma vacina melhorada contra a tuberculose e, compatível com o diagnóstico em bovinos. Uma única vacina para controle tanto da TB humana quanto da bTB traria benefícios tanto para a saúde pública quanto ganhos econômicos.