Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia.

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2022
Autor(a) principal: Costa, Hernan Hermes Monteiro da
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24102023-112317/
Resumo: O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus emergente da família Flaviviridae, e um problema atual em todo o mundo, principalmente devido às síndromes congênitas e neurológicas associadas a ele. Como os sintomas clínicos iniciais das doenças causadas pelos flavivírus são muito semelhantes, o diagnóstico clínico é difícil. Ainda, há grande complexidade em obter testes diagnósticos específicos e sensíveis, devido à alta similaridade antigênica entre estes arbovírus, e o tratamento por meio de imunoterapias representa um grande desafio, e ainda não foram alcançados. Sendo assim, esforços para a obtenção e avaliação de insumos como possíveis candidatos ao desenvolvimento de testes rápidos ou para uma imunoterapia se fazem necessários. Nesse trabalho, foi realizado a expressão, purificação e caracterização da proteína de envelope recombinante de ZIKV (rEZIKV) e quatro anticorpos recombinantes humanos do tipo scFv (single chain variable fragment) com especificidade ao ZIKV. Previamente, foi realizado três estratégias de biosseleções por Phage Display pelo nosso grupo, a partir do uso de bibliotecas de anticorpos recombinantes Fab expressos em fagos filamentosos, possibilitando a obtenção de milhares de sequências distintas por meio do sequenciamento de próxima geração (NGS) das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas de anticorpos. Na primeira estratégia, foi realizado a seleção diretamente contra ZIKV, sem pré-adsorção contra outro flavivírus. Na segunda e terceira estratégia, as sequências foram selecionadas por meio de uma abordagem subtrativa de seleção negativa e positiva contra vírus Dengue sorotipo 2 (DENV2) e ZIKV, respectivamente. Inicialmente foi realizado a expressão da proteína rEZIKV em E. coli a fim de produzir antígenos para a validação dos anticorpos monoclonais. Foi utilizado um biorreator Airlift com volume de 5 L e purificação em coluna de níquel em um sistema automatizado de cromatografia. A proteína rEZIKV teve rendimento de 20mg/L e manteve sua antigenicidade e imunogenicidade. Posteriormente, com base em análises do programa ATTILA, usando como parâmetro de escolha o enriquecimento das sequências após cinco ciclos de biosseleção, foram escolhidas quatro sequencias de scFvs anti-ZIKV. As sequencias gênicas foram sintetizadas e clonadas em vetor pET-SUMO e expressadas em sistema heterólogo de células bacterianas, purificados por afinidade em um sistema de cromatografia automatizado. Foi demonstrado que os quatro scFvs se ligam à proteína rEZIKV e às partículas maduras de ZIKV tanto por ELISA quanto por western blot. Ainda, outros quatro scFvs anti-ZIKV da segunda e terceira estratégia foram selecionados pelo programa ATTILA, sintetizados e clonados em vetor pCOd600, que contém a sequência Fc de IgG1 humana, gerando um anticorpo no formato FvFc. Desta forma, avançamos na criação e caracterização de um banco de anticorpos monoclonais recombinantes a fim de estabelecer estratégias para o desenvolvimento de diagnóstico diferencial ou mesmo imunoterapias para o tratamento de infecções geradas pelo ZIKV. Os novos insumos gerados neste trabalho parecem ser promissores e novos ensaios serão realizados a fim de avaliar a viabilidade para sua utilização no manejo de infecções por ZIKV.
id USP_6487937c11cd6aae25ad0f7856660a41
oai_identifier_str oai:teses.usp.br:tde-24102023-112317
network_acronym_str USP
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
repository_id_str
spelling Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia.Development of human and humanized monoclonal antibodies anti-Flavivirus with neutralizing potential: prospection, characterization and use in diagnostic and therapyAnticorpos monoclonaisFlavivirusFlavivírusMonoclonal antibodiesPhage displayPhage displayscFvscFvVírus ZikaZika virusO vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus emergente da família Flaviviridae, e um problema atual em todo o mundo, principalmente devido às síndromes congênitas e neurológicas associadas a ele. Como os sintomas clínicos iniciais das doenças causadas pelos flavivírus são muito semelhantes, o diagnóstico clínico é difícil. Ainda, há grande complexidade em obter testes diagnósticos específicos e sensíveis, devido à alta similaridade antigênica entre estes arbovírus, e o tratamento por meio de imunoterapias representa um grande desafio, e ainda não foram alcançados. Sendo assim, esforços para a obtenção e avaliação de insumos como possíveis candidatos ao desenvolvimento de testes rápidos ou para uma imunoterapia se fazem necessários. Nesse trabalho, foi realizado a expressão, purificação e caracterização da proteína de envelope recombinante de ZIKV (rEZIKV) e quatro anticorpos recombinantes humanos do tipo scFv (single chain variable fragment) com especificidade ao ZIKV. Previamente, foi realizado três estratégias de biosseleções por Phage Display pelo nosso grupo, a partir do uso de bibliotecas de anticorpos recombinantes Fab expressos em fagos filamentosos, possibilitando a obtenção de milhares de sequências distintas por meio do sequenciamento de próxima geração (NGS) das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas de anticorpos. Na primeira estratégia, foi realizado a seleção diretamente contra ZIKV, sem pré-adsorção contra outro flavivírus. Na segunda e terceira estratégia, as sequências foram selecionadas por meio de uma abordagem subtrativa de seleção negativa e positiva contra vírus Dengue sorotipo 2 (DENV2) e ZIKV, respectivamente. Inicialmente foi realizado a expressão da proteína rEZIKV em E. coli a fim de produzir antígenos para a validação dos anticorpos monoclonais. Foi utilizado um biorreator Airlift com volume de 5 L e purificação em coluna de níquel em um sistema automatizado de cromatografia. A proteína rEZIKV teve rendimento de 20mg/L e manteve sua antigenicidade e imunogenicidade. Posteriormente, com base em análises do programa ATTILA, usando como parâmetro de escolha o enriquecimento das sequências após cinco ciclos de biosseleção, foram escolhidas quatro sequencias de scFvs anti-ZIKV. As sequencias gênicas foram sintetizadas e clonadas em vetor pET-SUMO e expressadas em sistema heterólogo de células bacterianas, purificados por afinidade em um sistema de cromatografia automatizado. Foi demonstrado que os quatro scFvs se ligam à proteína rEZIKV e às partículas maduras de ZIKV tanto por ELISA quanto por western blot. Ainda, outros quatro scFvs anti-ZIKV da segunda e terceira estratégia foram selecionados pelo programa ATTILA, sintetizados e clonados em vetor pCOd600, que contém a sequência Fc de IgG1 humana, gerando um anticorpo no formato FvFc. Desta forma, avançamos na criação e caracterização de um banco de anticorpos monoclonais recombinantes a fim de estabelecer estratégias para o desenvolvimento de diagnóstico diferencial ou mesmo imunoterapias para o tratamento de infecções geradas pelo ZIKV. Os novos insumos gerados neste trabalho parecem ser promissores e novos ensaios serão realizados a fim de avaliar a viabilidade para sua utilização no manejo de infecções por ZIKV.The Zika virus (ZIKV) is an emerging arbovirus of the Flaviviridae family, and a current problem worldwide, mainly due to the congenital and neurological syndromes associated with it. As the initial clinical symptoms of diseases caused by flaviviruses are very similar, clinical diagnosis is difficult. Still, there is great complexity in obtaining specific and sensitive diagnostic tests, due to the high antigenic similarity between these arboviruses, and treatment through immunotherapies represents a great challenge, and they have not yet been achieved. Therefore, efforts to obtain and evaluate inputs as possible candidates for the development of rapid tests or for immunotherapy are necessary. In this work, the expression, purification and characterization of the recombinant envelope protein of ZIKV (rEZIKV) and four human recombinant antibodies of the scFv type (single chain variable fragment) with specificity to the ZIKV were carried out. Previously, three Phage Display bioselection strategies were carried out by our group, using libraries of recombinant Fab antibodies expressed in filamentous phages, making it possible to obtain thousands of distinct sequences through next-generation sequencing (NGS) of the regions variables of the light and heavy chains of antibodies. In the first strategy, selection was performed directly against ZIKV, without pre-adsorption against another flavivirus. In the second and third strategies, the sequences were selected through a subtractive approach of negative and positive selection against Dengue virus serotype 2 (DENV2) and ZIKV, respectively. Initially, the expression of the rEZIKV protein in E. coli was carried out in order to produce antigens for the validation of monoclonal antibodies. An Airlift bioreactor with a volume of 5 L and nickel column purification in an automated chromatography system was used. The rEZIKV protein had yield of 20mg/L and maintained its antigenicity and immunogenicity. Subsequently, based on analysis of the ATTILA program, using sequence enrichment after five cycles of bioselection as a choice parameter, four anti-ZIKV scFv sequences were chosen. The gene sequences were synthesized and cloned in pET-SUMO vector and expressed in a heterologous system of bacterial cells, purified by affinity in an automated chromatography system. The four scFvs were shown to bind to the rEZIKV protein and to mature ZIKV particles by both ELISA and western blot. In addition, four other anti-ZIKV scFvs of the second and third strategies were selected by the ATTILA program, synthesized and cloned in pCOd600 vector, which contains the human IgG1 Fc sequence, generating an antibody in the FvFc format. Thus, we have advanced in the creation and characterization of a recombinant monoclonal antibody bank in order to establish strategies for the development of differential diagnosis or even immunotherapies for the treatment of infections generated by ZIKV. The new inputs generated in this work seem to be promising and new tests will be carried out in order to evaluate the feasibility for their use in the management of ZIKV infections.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPPrudencio, Carlos RobertoCosta, Hernan Hermes Monteiro da2022-08-01info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24102023-112317/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPReter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2024-10-15T14:40:42Zoai:teses.usp.br:tde-24102023-112317Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212024-10-15T14:40:42Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false
dc.title.none.fl_str_mv Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia.
Development of human and humanized monoclonal antibodies anti-Flavivirus with neutralizing potential: prospection, characterization and use in diagnostic and therapy
title Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia.
spellingShingle Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia.
Costa, Hernan Hermes Monteiro da
Anticorpos monoclonais
Flavivirus
Flavivírus
Monoclonal antibodies
Phage display
Phage display
scFv
scFv
Vírus Zika
Zika virus
title_short Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia.
title_full Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia.
title_fullStr Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia.
title_full_unstemmed Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia.
title_sort Desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos e humanizados anti-flavivírus com potencial neutralizante: prospecção, caracterização e uso em diagnóstico e terapia.
author Costa, Hernan Hermes Monteiro da
author_facet Costa, Hernan Hermes Monteiro da
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Prudencio, Carlos Roberto
dc.contributor.author.fl_str_mv Costa, Hernan Hermes Monteiro da
dc.subject.por.fl_str_mv Anticorpos monoclonais
Flavivirus
Flavivírus
Monoclonal antibodies
Phage display
Phage display
scFv
scFv
Vírus Zika
Zika virus
topic Anticorpos monoclonais
Flavivirus
Flavivírus
Monoclonal antibodies
Phage display
Phage display
scFv
scFv
Vírus Zika
Zika virus
description O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus emergente da família Flaviviridae, e um problema atual em todo o mundo, principalmente devido às síndromes congênitas e neurológicas associadas a ele. Como os sintomas clínicos iniciais das doenças causadas pelos flavivírus são muito semelhantes, o diagnóstico clínico é difícil. Ainda, há grande complexidade em obter testes diagnósticos específicos e sensíveis, devido à alta similaridade antigênica entre estes arbovírus, e o tratamento por meio de imunoterapias representa um grande desafio, e ainda não foram alcançados. Sendo assim, esforços para a obtenção e avaliação de insumos como possíveis candidatos ao desenvolvimento de testes rápidos ou para uma imunoterapia se fazem necessários. Nesse trabalho, foi realizado a expressão, purificação e caracterização da proteína de envelope recombinante de ZIKV (rEZIKV) e quatro anticorpos recombinantes humanos do tipo scFv (single chain variable fragment) com especificidade ao ZIKV. Previamente, foi realizado três estratégias de biosseleções por Phage Display pelo nosso grupo, a partir do uso de bibliotecas de anticorpos recombinantes Fab expressos em fagos filamentosos, possibilitando a obtenção de milhares de sequências distintas por meio do sequenciamento de próxima geração (NGS) das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas de anticorpos. Na primeira estratégia, foi realizado a seleção diretamente contra ZIKV, sem pré-adsorção contra outro flavivírus. Na segunda e terceira estratégia, as sequências foram selecionadas por meio de uma abordagem subtrativa de seleção negativa e positiva contra vírus Dengue sorotipo 2 (DENV2) e ZIKV, respectivamente. Inicialmente foi realizado a expressão da proteína rEZIKV em E. coli a fim de produzir antígenos para a validação dos anticorpos monoclonais. Foi utilizado um biorreator Airlift com volume de 5 L e purificação em coluna de níquel em um sistema automatizado de cromatografia. A proteína rEZIKV teve rendimento de 20mg/L e manteve sua antigenicidade e imunogenicidade. Posteriormente, com base em análises do programa ATTILA, usando como parâmetro de escolha o enriquecimento das sequências após cinco ciclos de biosseleção, foram escolhidas quatro sequencias de scFvs anti-ZIKV. As sequencias gênicas foram sintetizadas e clonadas em vetor pET-SUMO e expressadas em sistema heterólogo de células bacterianas, purificados por afinidade em um sistema de cromatografia automatizado. Foi demonstrado que os quatro scFvs se ligam à proteína rEZIKV e às partículas maduras de ZIKV tanto por ELISA quanto por western blot. Ainda, outros quatro scFvs anti-ZIKV da segunda e terceira estratégia foram selecionados pelo programa ATTILA, sintetizados e clonados em vetor pCOd600, que contém a sequência Fc de IgG1 humana, gerando um anticorpo no formato FvFc. Desta forma, avançamos na criação e caracterização de um banco de anticorpos monoclonais recombinantes a fim de estabelecer estratégias para o desenvolvimento de diagnóstico diferencial ou mesmo imunoterapias para o tratamento de infecções geradas pelo ZIKV. Os novos insumos gerados neste trabalho parecem ser promissores e novos ensaios serão realizados a fim de avaliar a viabilidade para sua utilização no manejo de infecções por ZIKV.
publishDate 2022
dc.date.none.fl_str_mv 2022-08-01
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24102023-112317/
url https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24102023-112317/
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.none.fl_str_mv
dc.rights.driver.fl_str_mv Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais.
info:eu-repo/semantics/openAccess
rights_invalid_str_mv Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais.
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.coverage.none.fl_str_mv
dc.publisher.none.fl_str_mv Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
publisher.none.fl_str_mv Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
dc.source.none.fl_str_mv
reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
instname:Universidade de São Paulo (USP)
instacron:USP
instname_str Universidade de São Paulo (USP)
instacron_str USP
institution USP
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)
repository.mail.fl_str_mv virginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.br
_version_ 1815257750750363648