Interação entre o fator de transcrição CG9571 e módulos reguladores do gene pair-rule even-skipped da cascata de segmentação de Drosophila - Gueller, Geison Castro da Silveira (2019)
O desenvolvimento do padrão de segmentação de Drosophila é estabelecido por uma cascata de genes de segmentação zigóticos. Estes genes são divididos em três classes (gap, pair-rule e segment-polarity) e codificam para fatores de transcrição (FT) que se ligam a módulos cis-reguladores (CRMs), reprimindo ou ativando genes alvo. A faixa 2 do gene pair-rule even-skipped (eve 2) é ativada pelos fatores maternos Bicoid e Hunchback e reprimida pelas proteínas gap Giant (Gt) e Krüppel. Estudos posteriores mostraram que o FT Sloppy-paired 1 (Slp 1) e provavelmente um outro FT forkhead também atuam na repressão de eve 2. O gene anotado CG9571 foi isolado em uma varredura como proteína forkhead candidata a repressão de eve 2. Estudos genéticos confirmaram essa possibilidade e revelaram que eve 1 também pode ser alvo deste FT. Este trabalho teve como objetivo verificar a interação de CG9571 com os CRMs eve 1 e eve 2. Para tanto, planejamos obter o domínio de ligação da proteína (CG9571 BD) e da proteína completa (CG9571 FL) e testar suas interações in vitro com fragmentos dos CRMs por meio da técnica de retardo da mobilidade eletroforética (EMSA). Obtivemos a quantidade necessária de DNA para os experimentos através de PCR e preparações plasmidiais de versões clonadas destes CRMs que já dispúnhamos em laboratório. Realizamos tentativas de obtenção de CG9571 BD por transcrição e tradução in vitro, mas esta estratégia não foi bem-sucedida e adotamos a estratégia de clonagem em vetor para expressão em células competentes bacterianas. O fragmento de CG9571 BD foi clonado com sucesso, mas não conseguimos verificar a expressão do polipeptídeo em duas linhagens de E. coli. Alteramos novamente nossa estratégia e clonamos o fragmento correspondente a CG9571 FL em vetor de expressão e conseguimos induzir sua expressão em bactéria, embora não tenha sido obter a proteína recombinante em forma solúvel. Prosseguimos para tentativas de recuperação da proteína a partir de corpos de inclusão. Foram empregados diferentes métodos para solubilização, renovelamento e purificação da proteína. Extratos da fração insolúvel solubilizada em diferentes concentrações de ureia foram submetidos a tentativas de purificação e renaturação por cromatografia de afinidade, mas não houve adsorção significativa de CG9571 FL em colunas com Ni2+ imobilizado. Preparações não puras contendo CG9571 FL foram obtidas através de procedimentos de renaturação destes extratos e foram utilizadas em ensaios de interação com os CRMs. Não houve detecção de retardo da mobilidade eletroforética dos fragmentos em gel. Foram observados efeitos de redução da quantidade de DNA detectado com brometo de etídio nas interações, mas este efeito foi considerado produto da ação de possíveis nucleases contaminantes nas preparações após investigação. Preparações de CG9571 FL puras foram obtidas por purificações a partir de SDS-PAGE, mas a maioria das interações da proteína solúvel com eve 1 e eve 2 não indicou formação de complexo. Obtivemos um único resultado positivo para a interação entre CG9571 FL e eve 2. Por não ter sido reproduzido, consideramos o resultado inconclusivo e novos experimentos serão conduzidos para dar continuidade à investigação da hipótese do trabalho