Genética e melhoramento de leveduras para a biconversão de extratos de H. tuberosus L. - Echeverrigaray Laguna, Sergio (1986)
O presente trabalho teve como principais objetivos estabelecer quais as leveduras mais adequadas a fermentação alcoólica e à produção de xaropes de frutose, a partir de inulina de extrato de tubérculos de H. tuberosus. Para tanto foram desenvolvidos experimentos de seleção de leveduras, avaliação da atividade inulinolítica extracelular, estudo de parâmetros cinéticos e estudos genéticos importantes para o melhoramento destes organismos. A seleção de leveduras permitiu estabelecer que as espécies mais adequadas à fermentação de extratos de H. tuberosus são K. marxianus, K. fragilis e C. pseudotropicalis. Com leveduras selecionadas foi possível desenvolver fermentações de 12 horas com 9,87°GL de etanol e rendimentos de 96,56%, com produtividade volumétrica de 7,87 g.l-1.h -1 e produtividade de específica de 2,35.g. g-1.h -1, o que torna o processo de fermentação deste substrato comparável com as fermentações de cana-de-açúcar. As linhagens testadas de K. marxianus, K. fragilis e C. pseudotropicalis exibiram altas atividades inulinolíticas extracelulares, o mesmo não ocorrendo nas linhagens de S. cerevisiae, C. guillemondii e T. colliculosa, nas quais não foi possível detectar atividade extracelular desta enzima. Os dados obtidos mostraram que a inulinase extracelular de K. marxianus não apresenta repressão catabólica, e a sua síntese mesmo sendo constitutiva foi estimulada por inulina, sacarose e celobiose. Por outro lado, a inulinase extracelular de K. fragilis sofre repressão catabólica e retroinibição em concentrações de açúcares redutores superiores a 3x10-3M, sendo a sua síntese induzida por inulina e por ?-fructosídios (incluindo sacarose). Observou-se adicionalmente que os extratos enzimáticos de Kluyveromyces, apresentam dois pH ótimos (p H 4,0·e 7,0) de atividade inulinolítica , e são sensíveis a temperaturas superiores a 50°C. Dentre as linhagens testadas, três de K. marxianus exibiram caráter killer a pH 4,5, sendo a sua toxina muito ativa sobre leveduras do gênero Saccharomyces, mas não sobre o próprio gênero. O caráter killer nestas leveduras está associado à presença de dois plasmídios de DNA (pM1 e pM2) e a resistência à própria toxina deve-se a genes nucleares. Sendo a toxina muito eficiente no controle de contaminantes de Saccharomycesdurante a multiplicação, está levedura pode vir a ser usada onde a presença destas leveduras não for desejada. As linhagens de K. marxianus não exibe reação sexual definida e as taxas de hibridização foram muito reduzidas, tanto em cruzamentos intra, como interespecíficos. Es te aspecto não foi limitante para os estudos genéticos, permitindo a identificação de dois genes inulinolíticos designados lnl1 e lnl2, presentes respectivamente em IZ 1339 e IZ 619. Estes genes estão ligados a 10 cm, e quando os alelos lnl1 e lnl2, estão presentes na mesma linhagem ocorre interação que resulta em atividades muito superiores aos genes individuais. A variação entre segregantes de híbridos de K. marxianus mostrou-se significativa, sendo obtidos segregantes com capacidade fermentativa superior aos parentais e as linhagens selecionadas. As técnicas recombinogênicas empregadas mostraram-se eficientes e este resultado mostra o grande potencial de resposta de métodos que envolvem a recombinação nestas leveduras. Mesmo os métodos não convencionais de cruzamento mostraram-se viáveis, sendo os produtos de fusão entre K. marxianus e K. lactis estáveis, produzindo ascos com esporos reniformes, porém com baixa viabilidade. Estes produtos de fusão apresentaram boa capacidade de fermentação de glicose, extratos de H. tuberosus lactose, exibindo também o caráter killer do parental K. marxianus Os resultados permitem concluir que a fermentação de extratos de H. tuberosus e a produção de enzimas inulinolíticas por apresentarem produtividades e rendimentos elevados que possibilitam a produção econômica de etanol e xarope de frutose via hidrólise enzimática a partir deste vegetal. Através do melhoramento das leveduras do gênero Kluyveromyces e da produção agrícola de H. tuberosus, estes processos podem ser mais econômicos e portanto com maior potencial de competição com outras tecnologias existentes.