A conexina 26 e sua relação com outras proteínas no órgão de Corti - Batissoco, Ana Carla (2011)
A causa mais frequente de surdez de herança autossômica recessiva são as mutações no lócus DFNB1, onde estão os genes GJB2 e GJB6. Dentre os indivíduos com deficiência auditiva associada a esse lócus, 10% a 50% apresentam uma única mutação recessiva no gene GJB2, frequência muito superior à esperada em função da frequência de heterozigotos na população geral. Apesar de alguns desses casos terem sido elucidados após a identificação de grandes deleções no gene GJB6 ou nas suas proximidades, a existência de muitos indivíduos com uma única mutação patogênica no gene GJB2 sugere que a haplo-insuficiência nesse gene possa interagir com outras mutações no mesmo gene, no gene GJB6 vizinho, ou até em outros genes. O objetivo desse estudo foi identificar novos alelos patogênicos, novas proteínas e novos genes que interagem com o lócus DFNB1, do ponto de vista molecular e celular, e que possam ser responsáveis por surdez de herança autossômica recessiva. Desse modo, pretendemos contribuir para o esclarecimento da patogênese da surdez de herança autossômica recessiva. Nesse trabalho, três tipos de estudos foram realizados, com metodologias próprias. Na primeira parte, buscamos identificar novos alelos patogênicos no lócus DFNB1 que poderiam ser responsáveis por surdez quando presentes em heterozigose composta com outros alelos patogênicos nos genes GJB2 e GJB6. Foi realizada a análise do DNA de 16 pacientes surdos portadores de uma única mutação patogênica em um desses dois genes por meio: (i) do sequenciamento das regiões codificadora, promotora e doadora de splicing (intron 1) do gene GJB2, (ii) da triagem de uma deleção de 200 kb localizada a 130 kb da proximidade distal da região 5\' do gene GJB6 e (iii) da pesquisa de variações no número de cópias de um ou mais exons dos genes GJB2, GJB6, GJB3 e WFS1 por MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Detectamos uma segunda mutação provavelmente patogênica em dois dos 16 pacientes heterozigotos: em um deles, a mutação p.L76P (c.C227T) foi identificada na região de código do gene GJB2 e foi por nós descrita pela primeira vez; no segundo caso, uma duplicação (0,4-1,2Kb) que inclui a região de código do gene GJB2 foi detectada, também inédita na literatura. Na segunda parte, tivemos como objetivo obter um modelo experimental para estudos funcionais in vitro da proteína codificada pelo gene GJB2, a conexina 26, em seu local de expressão que são as células de suporte do órgão de Corti. Padronizamos o cultivo in vitro de células progenitoras do órgão de Corti de camundongos e de cobaias e conseguimos obter a diferenciação in vitro das otoesferas dos camundongos em células que expressam marcadores de células ciliadas (Miosina VIIa e Jagged2) e de células de suporte (p27kip e Jagged1). Por fim, na terceira parte, buscamos por proteínas que interagem com a conexina 26 por meio de ensaios de precipitação por afinidade. Para isso, produzimos clones recombinantes de uma proteína de fusão GST-Cx26 e de uma proteína controle (GST), e realizamos sua expressão in vitro em bactérias E.coli B21. Ensaios de precipitação por afinidade entre a proteína de fusão GST-Cx26 ou GST sozinha e proteínas extraídas de cérebro ou fígado de camundongos foram realizados em diferentes condições. A identificação e a análise das proteínas presentes em bandas de SDS-PAGE, obtidas no ensaio de precipitação com a proteína de fusão GST-Cx26 e ausentes no ensaio com a GST, foram realizadas por espectrometria de massas. Identificamos um total de 49 proteínas candidatas a interagirem com a região C-terminal da Cx26. Realizamos diversas análises in silico e em literatura específica e após exclusão de candidatas por: (i) redundância de representação no ensaio GST-Cx26, (ii) diferença entre a massa molecular esperada e a obtida, (iii) precipitação inespecífica e (iv) localização subcelular incompatível com a conexina 26, selecionamos um total de 22 proteínas candidatas a interagirem com a região C-terminal da conexina 26, para estudos futuros. A confimação da interação entre essas 22 proteínas e a conexina 26 é desejável por meio de estudos de co-localização e imuno-coprecipitação