Efeitos dos domínios hinge-transmembrana e transdução de sinal de GXMR-CAR na indução da ativação de células T e NK frente ao Cryptococcus spp. - Santos, Matheus Henrique dos (2022)
As infecções fúngicas invasivas (IFIs) representam um sério problema de saúde pública. Dentre as doenças negligenciadas, as IFIs apresentam taxas de mortalidade em patamares semelhantes aos ocasionados pela malária ou tuberculose. A criptococose, manifestação da infecção causada por Cryptoccocus spp., é responsável por cerca de 180.000 mortes anuais globalmente. O comprometimento do sistema imune é o maior fator de risco para o estabelecimento da infecção, e as espécies Cryptococcus gattii e Cryptococcus neoformans são as de maior relevância clínica, podendo acometer tanto indivíduos imunocomprometidos quanto imunocompetentes. Esses patógenos apresentam um diverso arsenal de fatores de virulência e mecanismos de escape/subversão da resposta imunológica do hospedeiro, seja impedindo ou sobrevivendo à fagocitose, ou comprometendo a diferenciação e atuação de subtipos de células T importantes no controle da infecção. Para contornar esse processo, a presente dissertação avaliou o redirecionamento de células T e natural killer (NK) para o reconhecimento de Cryptoccocus spp. via interação com o polissacarídeo glucuronoxilomanana (GXM) presente na cápsula desse patógeno. Para isso, o receptor antigênico quimérico (CAR) com capacidade de reconhecer GXM, denominado GXMCAR, foi expresso em células T e NK através da transdução com partículas lentivirais. O redirecionamento e efeitos funcionais desencadeado por diferentes GXMR-CAR foi avaliado frente a Cryptococcus spp., sendo considerado os receptores caracterizados pelas seguintes diferenças estruturais: porções hinge-transmembrana, com IgG4-hinge e CD28-transmembrana, GXMR-IgG4-28ζ; hinge-transmembrana contendo CD8α acoplado com domínio de transdução de sinal 4-1BB ou CD28, GXMR-8-BBζ e GXMR-8-28ζ, respectivamente. Células Jurkat foram adotadas como plataforma de expressão de GXMR-CAR e de avaliação frente a C. gattii R265, C. neoformans H99 ou isolados clínicos. Células da linhagem NK-92 foram consideradas na expressão de GXMR-CAR para avaliar o controle da infecção in vitro por Cryptococcus spp. A modificação de células Jurkat com GXMR-CAR demonstrou uma maior expressão dos construtos contendo CD8α como hinge-transmembrana. A expressão de GXMR-8-BBζ ou GXMR8-28ζ propiciou melhor taxa de expansão celular comparado com as células expressando GXMR-IgG4-28ζ. A modificação com GXMR-CAR contendo CD8α como hinge/transmembrana induziu a sinalização tônica em células Jurkat, e a molécula coestimulatória 4-1BB desencadeou os maiores níveis de produção de IL-2 em comparação com CD28. Mesmo na presença da sinalização tônica, GXMR-8-BBζ ou GXMR-8-28ζ induziram um aumento significativo nos níveis de IL-2 após a incubação com GXM solúvel ou leveduras inativadas de Cryptococcus spp, enquanto a expressão de GXMRIgG4-28ζ não induziu a ativação das células. A inibição da via de sinalização do GXMRCAR com o fármaco dasatinibe, inibidor de tirosina quinases da família Src, atenuou a sinalização tônica mediada por GXMR-8-137z e GXMR-8-28z. Além disso, as células modificadas com GXMR-CAR tiveram redução da taxa proliferativa após a incubação com as leveduras inativadas, fato atenuada com a adição de dasatinibe no cultivo celular. Em complemento, células Jurkat transduzidas com GXMR-8-BBζ ou GXMR-8-28ζ são capazes de reconhecerem diferentes sorotipos de C. gattii e C. neoformans derivados de isolados clínicos, e isso resultou na ativação celular. A expressão dos diferentes GXMRCAR na linhagem celular NK-92 demonstrou maiores taxas de expressão dos construtos contendo CD8α como hinge-transmembrana, com a frequência de células modificadas com GXMR-CAR se mantendo relativamente estável por prolongados períodos de cultivo. A atividade fungicida das células NK-92 modificadas com GXMR-8-BBζ foi avaliada frente ao Cryptococcus spp., e o co-cultivo das células com as leveduras resultou na produção de elevados níveis de INF-γ, além disso, a expressão de GXMR-8-BBζ medeia a sinalização tônica de células NK-92. Essas células foram capazes de aumentarem a susceptibilidade de Cryptococcus spp. frente a anfotericina B, enquanto o efeito fungicida e fungistático não foi alcançado. Em conclusão, a caracterização de distintos construtos de GXMR-CAR frente ao ligante, em diferentes tipos celulares, elencou os domínios de GXMR-CAR que resultaram em melhor funcionalidade do receptor na presença de Cryptococcus spp.