Simulando o microambiente na esclerose sistêmica: soro de pacientes transplantados e cultivo celular no estudo da inflamação e fibrose cutânea - Silva, Djúlio César Zanin da (2025)
A esclerose sistêmica (ES) é uma doença autoimune caracterizada por uma tríade patológica de lesão vascular, desregulação imunológica e fibrose da pele e de órgãos internos. O TACTH é alternativa para formas graves e progressivas de ES e, embora promova remodelamento do tecido conjuntivo, efeitos na epiderme são desconhecidos. A complexa interação entre células envolvidas no eixo patológico inflamação-fibrose requer modelos experimentais que incorporem estes componentes, simulando o microambiente da doença. Neste trabalho, desenvolvido em duas fases, utilizamos abordagens in vitro com queratinócitos, (mio)fibroblastos e monócitos/macrófagos tendo como objetivo esclarecer mecanismos fisiopatológicos do envolvimento cutâneo na ES. Na primeira, focamos na desregulação de queratinócitos na epiderme e sua provável associação com desfechos clínicos em pacientes submetidos ao transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (TACTH) (ESTUDO 1). Assim, no ESTUDO 1, analisamos se o TACTH altera o estado inflamatório e de ativação da epiderme. Integramos análises histopatológicas em biópsias de pele, quantificação de moléculas séricas e dados clínicos de pacientes (pré e seis meses pós-TACTH), com o cultivo de uma linhagem de queratinócitos humanos (células HaCaT) exposta ao soro dos pacientes de ambos os períodos. A hipótese era de que o TACTH reduziria o estado inflamatório e de ativação dos queratinócitos nas biópsias de pele. In vitro, quando expostos ao soro dos pacientes pós-TACTH, os queratinócitos apresentariam mudanças que refletissem um microambiente de diminuição de sinais fibroinflamatórios. Nos resultados, em paralelo à melhora clínica da pele, observamos que o TACTH diminuiu significativamente a espessura da epiderme. A expressão de S100A9, IL-1α, TNF-α e Ki-67 também se alterou na pele pós-TACTH, indicando uma redução visível da inflamação e ativação/proliferação dos queratinócitos. No soro, o TACTH diminuiu os níveis do fator de crescimento epidérmico (EGF) e da interleucina (IL)-1α, e normalizou as concentrações do fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF). A exposição das HaCaT ao soro dos pacientes transplantados reduziu a liberação de CCL-5, associada à via de sinalização NF-κB. Assim, constatamos que houve melhora parcial da epiderme seis meses pós-TACTH, justificando estudos futuros que avaliem vias e mecanismos específicos sobre este compartimento. Na segunda etapa (ESTUDO 2), avançamos para um modelo tridimensional (3D) de co-cultivo entre monócitos/macrófagos e fibroblastos em hidrogéis de colágeno, analisando mecanismos e vias de sinalização relacionados à ativação e contração dos (mio)fibroblastos, que refletem a rigidez e fibrose de pele na ES. A hipótese era de que os monócitos levariam à contração e ativação dos (mio)fibroblastos nos hidrogéis. Nos resultados, observamos que os monócitos promoveram forte contração dos (mio)fibroblastos (vista pela redução da área dos hidrogéis), juntamente com a regulação positiva de marcadores de ativação, como a actina-alfa de músculo liso (α-SMA) e a proteína ativadora de fibroblastos (FAP). Com fibroblastos repórteres e inibidores farmacológicos (SB-505124 e tofacitinibe), demonstramos que a comunicação fibroblastos-monócitos foi mediada pelas vias de sinalização JAK/STAT e TGF-β/Smad. Também identificamos, por citometria de fluxo, que a interação com fibroblastos levou aos monócitos à diferenciação em macrófagos com fenótipo misto de polarização M1/M2, com expressão concomitante de CD163, CD206, CD86 e HLADR. Finalmente, adicionando macrófagos M1 ou M2-like aos hidrogéis, uma robusta contração foi semelhantemente observada. Hidrogéis contendo apenas fibroblastos expostos ao sobrenadante de macrófagos M1 ou M2-like se contraíram fortemente, efeito abolido com a neutralização de TGF-β. Em conjunto, nosso trabalho contribui para elucidar vias e mecanismos associados a inflamação e fibrose cutânea na esclerose sistêmica e favorece o desenvolvimento de novas plataformas para pesquisas terapêuticas.