Cromatografia líquida multidimensional para microextração e análise automatizada de canabinoides em fluidos biológicos - Sartore, Douglas Morisue (2024)
Os canabinóides, compostos presentes nas plantas de Cannabis, são substâncias que apresentam atividade farmacológica e atualmente estão compreendidos em importantes tópicos de pesquisa, principalmente nos campos de toxicologia e medicina. Mais de 100 compostos já foram identificados e classificados como canabinóides, nas plantas de Cannabis. Por apresentar compostos psicoativos, em especial o tetrahidrocanabinol (THC), a Cannabis é ainda considerada uma droga ilícita (com o maior número de usuários no mundo) em muitas partes do planeta. No entanto, nas últimas décadas, os canabinóides têm sido parte de novas descobertas no campo medicinal e vêm sendo indicados para uso terapêutico de uma série de doenças. Assim, tanto pelo viés toxicológico quanto pelo medicinal, tornam-se necessários novos métodos analíticos para determinação dessas substâncias em diferentes matrizes. Além disso, são desejáveis métodos que consigam identificar e quantificar o maior número possível de canabinóides, em uma única corrida analítica. Seguindo esses princípios, o trabalho de doutorado aqui apresentado utilizou a técnica de microextração denominada de in-tube solid phase microextraction (IT-SPME) acoplada à cromatografia líquida (LC) e espectrometria de massas sequencial (MS/MS) para identificação e quantificação tanto de canabinóides quanto de alguns metabólitos, em urina e em saliva humana, com manipulação mínima da amostra. Essa técnica de cromatografia multidimensional faz uso de duas colunas; uma coluna extratora para a microextração dos analitos e outra coluna analítica, para separação dos compostos que seguem para detecção. Para produção das microcolunas e análise de urina foram utilizados hardware de aço inoxidável reutilizável (508 µm i.d. x 50 mm) e apenas 12 mg de fase sólida extratora comercial. Já para a análise de saliva, foram produzidas colunas similares, em hardware de aço inoxidável reutilizável (508 µm i.d. x 100 mm) e 24 mg de fase sólida extratora. Nesse caso, a fase comercial foi superficialmente modificada com imobilização de BSA, para realizar exclusão de macromoléculas durante o preparo de amostra, aumentando sua seletividade para a análise de amostras de saliva. Após a avaliação de diferentes fases sólidas extratoras; (e modificação superficial, no caso do método para saliva) utilizou-se um planejamento fatorial fracionário (24-1), seguido de um planejamento de composto central (CCD) para otimização de condições de microextração. Sob condições otimizadas, os métodos foram validados, requerendo apenas 250 µL de amostra de urina ou saliva e 500 µL de solvente orgânico. Para ambas as matrizes, não foi necessária etapa de hidrólise, permitindo a determinação dos diferentes metabólitos do THC e outros canabinóides. Além disso, a única etapa manual do preparo de amostra incluiu apenas uma simples diluição, seguida de centrifugação. Dessa maneira, o procedimento total de preparo de amostra, seguido pela corrida cromatográfica, levou cerca de 20 minutos, permitindo uma frequência analítica de 3 amostras de urina h-1. Para as amostras de saliva, o procedimento total de preparo de amostra, seguido pela corrida cromatográfica, levou cerca de 26,25 minutos, permitindo uma frequência analítica de 2,3 amostras de saliva h-1. Após validação, os métodos foram aplicados com sucesso para análise de 20 amostras autênticas de urina e 50 amostras autênticas de saliva. Finalmente, ambos os métodos se apresentaram como alternativas competitivas para análise de rotina de canabinóides em urina e saliva, principalmente em termos de facilidade do pré-tratamento e preparo de amostra e frequência analítica, dispensando o uso de dispositivos comerciais de extração.