Caracterização das subunidades da hemoglobina de Glossoscolex paulistus - Boidart, Maria Helena Tinto (1995)
A cromatografia em Sephadex G-200 da hemoglobina do anelídeo Glossoscolex paulistus evidencia uma única banda a pH 7,0 e várias bandas a pH 9,0, devido à dissociação da proteína em meio alcalino. A eletroforese SDS-PAGE da proteína íntegra obtida a pH 7,0 mostra a existência de cinco bandas diferentes, com pesos moleculares (PM) de 12 ± 1 kDa, 26 ± 3 kDa, 28 ± 2 kDa, 34 ± 1 kDa e 53 ± 1 kDa. Na presença de β-mercaptoetanol, seis bandas distintas são obtidas, com PM de 13 ± 1 kDa, 14,8 ± 0,3 kDa, 15,8 ± 0,2 kDa, 16,6 ± 0,2 kDa, 35,1 ± 0,3 kDa e 40,5 ± 0,5 kDa. A redução das pontes dissulfeto conduz ao aparecimento das subunidades monoméricas de 14,8 kDa, 15,8 kDa e 16,6 kDa, originadas do trímero de 53 kDa. Os PMs obtidos pela cromatografia em Sephadex G-200 a pH 9,0 diferem dos valores obtidos por SDS-PAGE. Uma banda intensa a 110 ± 12 kDa, atribuída à dimerização do trímero ou tetrâmero (trímero + monômero), (αβγδ)2, é observada, juntamente com uma fração pequena de PM elevado eluída no volume de exclusão e duas frações adicionais atribuídas ao trímero (42 ± 2 kDa) e ao monômero (15 ± 2 kDa). O rendimento quântico de fluorescência (RQ), bem como os coeficientes de extinção a 280 nm e 415 nm, foram estimados e comparados com a hemoglobina humana para as diferentes frações obtidas na cromatografia. Os dados de fluorescência evidenciaram o alto conteúdo de resíduos de aminoácidos aromáticos na hemoglobina de Glossoscolex paulistus. O aumento do rendimento quântico em meio alcalino está correlacionado à exposição dos resíduos de triptofano ao solvente, devido à dissociação. A proteína nativa intacta apresenta um rendimento quântico de 0,25% a pH 7,0, considerando-se 14% para a solução de triptofano. O trímero apresenta rendimento quântico de fluorescência de 1,2% e o monômero de 0,81% a pH 7,0. O comprimento de onda no máximo de emissão (327 nm) é consistente com resíduos de triptofano protegidos na proteína nativa, tornando-se significativamente mais expostos e mais fluorescentes com a dissociação em subunidades menores. A dissociação alcalina aumenta o rendimento quântico para 0,8% a pH 9,0.