Desenvolvimento das barras imunosorventes de agitação e avaliação das técnicas extração sortiva em barra de agitação, microextração em sorvente empacotado e cromatografia líquida para análise de antidepressivos em amostras de plasma - Leandro, Fernanda Zampieri (2010)
Neste trabalho, os anticorpos policlonais e monoclonais anti-fluoxetina foram produzidos em coelhos e camundongos, respectivamente, por imunização com o conjugado fluoxetina-soroalbumina bovina. Os anticorpos obtidos foram caracterizados em função da especificidade contra o fármaco por ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) e posteriormente, purificados por afinidade em coluna fluoxetina-agarose labmade. Os anticorpos purificados foram imobilizados covalentemente na superfície vítrea das barras SBSE (extração sortiva em barra de agitação) labmade. Após a derivatização das barras com 3-aminopropiltrietoxisilano, dois métodos distintos de acoplamento dos anticorpos às barras SBSE foram avaliados: ativação com glutaraldeído e succinilação seguida de ativação via éster N-hidroxisuccinimida (NHS). A funcionalização das barras SBSE foi comprovada através da imobilização de enzima peroxidase (HRP) em lugar do anticorpo e posterior ensaio enzimático com as barras. Várias barras SBSE com diferentes áreas (1,2; 2,4; e 4,0 cm2) foram preparadas, dentre as quais, as com maior área imunosorvente apresentaram maiores taxas de recuperação do fármaco. A avaliação da morfologia da superfície da barra SBSE imunosorvente foi realizada através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). As variáveis do processo SBSE de imunoafinidade foram otimizadas para estabelecer o equilíbrio de sorção antígeno-anticorpo em um menor tempo de análise e obtenção de limite de quantificação compatível com o intervalo terapêutico do fármaco. As capacidades adsortivas das barras imunosorventes foram de 1,2 e 8 microgramas por cm2 para anticorpos policlonais e monoclonais, respectivamente. Os imunosorventes desenvolvidos apresentaram reatividade-cruzada apenas com norfluoxetina (metabólito ativo de fluoxetina). As barras imunosorventes foram reutilizadas aproximadamente 30 vezes, sem perda significativa da eficiência das extrações. Baseados nos parâmetros de validação analítica avaliados, os métodos de SBSE/LC-FD de imunoafinidade desenvolvidos são adequados para a determinação de fluoxetina em amostras de plasma de pacientes em terapia com o fármaco, para fins de monitorização terapêutica. Por conseguinte, esses métodos foram aplicados com êxito para análises de amostras de plasma de pacientes idosos em terapia com Prozac®. Neste trabalho, o método MEPS (microextração em sorvente empacotado)/LC-UV também foi desenvolvido e validado para análise simultânea de sertralina, paroxetina, citalopram, fluoxetina e mirtazapina em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. As variáveis do processo MEPS foram otimizadas (pH e volume da amostra, força iônica, volume dos ciclos aspirar-dispensar e condições de dessorção) para estabelecer o equilíbrio de sorção em menor tempo de análise e obter sensibilidade analítica adequada para a determinação dos antidepressivos no intervalo terapêutico. O método MEPS/LC-UV desenvolvido permitiu integração da dessorção dos analitos e injeção da amostra no sistema cromatográfico (LC-UV) em uma única etapa, usando a microsseringa de extração MEPS. A fase extratora MEPS, M1 (C8/SCX), foi reutilizada mais de 50 vezes com perda mínima da eficiência da extração, comprovando a robustez do material sorvente. Segundo os parâmetros de validação analítica avaliados, o método MEPS/LC-UV desenvolvido é adequado para a determinação de antidepressivos em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica.