Estudo de sondas orgânicas e estratégias de marcação fluorescente de DNA: da fotoquímica básica à microscopia óptica de super-resolução - Lauer, Milena Helmer (2016)
A microscopia de fluorescência é uma das técnicas mais poderosas disponíveis atualmente, uma vez que proporciona uma combinação excepcional de alta sensibilidade na detecção, alta especificidade, além de ser consideravelmente não invasiva. Avanços recentes permitiram a detecção em resolução de subdifração, o que eleva sua potencialidade de investigação de um maior número de sistemas e, consequentemente, de avanço científico. O estudo de novas sondas fluorescentes é de fundamental importância para a aplicação em métodos avançados de microscopia óptica. Na primeira vertente da pesquisa, Capítulo 2, foi realizado o estudo fotofísico de uma série de compostos bisarilados derivados do anidrido maleico e de maleimidas sintetizados pela reação de Heck-Matsuda. Visando o aprimoramento do design dessas moléculas, foi realizada a ciclização fotoquímica de tais compostos, resultando em moléculas com anéis condensados, nomeados como derivados de fenantreno, as quais proporcionaram maior estabilidade fotoquímica. A dinâmica do estado excitado remete ao efeito push-pull, em que há um deslocamento de carga notável, mas não completo. Para os compostos com a substituição 4-hidroxifenil foi observado um processo de deslocamento de carga combinado com uma transferência de próton no estado excitado assistida por solvente. Ademais, o estudo dos compostos derivados de fenantreno em microscopia confocal demonstrou que as propriedades locais do solvente afetam a dinâmica de relaxação de fluorescência em diferentes meios condensados e que os mesmos são passíveis de serem aplicados a técnicas avançadas de microscopia de fluorescência. A segunda vertente desta tese, Capítulo 3, explora um sistema biológico em nível de uma única molécula. Especificamente, este capítulo concerne à investigação de uma metodologia ótima para a marcação fluorescente de DNA em sequência específica, através de microscopia de fluorescência com super-resolução. As reações foram conduzidas utilizando uma metodologia de marcação de duas etapas, de acordo com o princípio mTAG. Na primeira etapa, grupamentos contendo alquino terminal, azida ou amina primária são transferidos do cofator análogo ao S-adenosil-L-metionina para o DNA através de uma enzima metiltransferase. Foi utilizada a enzima M.TaqI, a qual tem como alvo a sequência 5\'- TGCA -3\' para modificação. Na segunda etapa é realizado o acoplamento do fluoróforo aos sítios funcionais do plasmídeo (pUC19) através de reações químicas bioortogonais, tais como reação click catalisada por cobre (CuAAC), reação click na ausência de cobre (SPAAC) e acoplamento do grupo amina primária com NHS-éster. Também foi desenvolvida uma metodologia direta de uma etapa, na qual o fluoróforo é diretamente transferido do cofator análogo para o DNA em uma única etapa reacional. Para acompanhar o desempenho das reações foi desenvolvido um ensaio single-molecule para a contagem do número de moléculas de corante ligadas a plasmídeos individuais. A topologia dos plasmídeos após a marcação foi investigada por imagens de AFM em alta resolução. A combinação de ambas as análises demonstrou que a reação SPAAC assim como a reação direta de uma etapa promoveram uma marcação fluorescente quase completa e a técnica de AFM confirmou que o acoplamento de fluoróforos não induziu danos à estrutura dos plasmídeos, os quais preservaram sua morfologia nativa, superenrolada. Além disso, os plasmídeos marcados foram aplicados com sucesso a procedimentos de transfecção em células de mamíferos, indicando que o DNA reteve sua capacidade de codificar informação genética, mesmo na presença de fluoróforos ligados.