Análise dos receptores P2X2 e P2X4 durante a diferenciação neuronal - Majumder, Paromita (2007)
Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, as oscilações da concentração de cálcio intracelular livre resultam na proliferação celular, migração e diferenciação neuronal. Nesta tese foram investigadas a participação dos receptores ionotrópicos purinérgicos dos tipos P2X2 e P2X4 seletivos ao influxo de cálcio durante a diferenciação neuronal in vitro das células de carcinoma embrionário murino P19. Identificamos o padrão diferencial de expressão de receptores purinérgicos nas células indiferenciadas e neurônios P19. O receptor P2X4 é expresso durante toda a diferenciação neuronal e o receptor P2X2 é detectado na fase tardia da diferenciação em neurônios. Através de ensaios farmacológicos, foi possível identificar a participação dos receptores metabotropicos P2Y e do receptor P2X4 na formação dos corpos embriônicos, na proliferação celular e ou na determinação do fenótipo de progenitor neural. Durante a maturação neuronal os receptores P2X2 e P2Y1 participam da determinação do fenótipo neuronal glutamatérgico NMDA e os receptores P2X2 e P2Y2 no fenótipo neuronal colinérgico. A ausência de inibidores específicos e seletivos aos receptores purinérgicos levou-nos a empregar a técnica SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) a fim de identificar inibidores seletivos aos receptores P2X2 e P2X4. A técnica envolve a utilização da biblioteca combinatória randômica de RNA 2\'- F pirimidina modificadas resistentes a nucleases. Após 9 ciclos de seleção in vitro de SELEX (ciclo 9-P2X4), as sequências selecionadas mostraram-se seletivas a ligação somente ao receptor P2X4 e não aos receptores P2X2 ou P2X7 através de ensaios de ligação radioligante-receptor. Por patch clamping na configuração whole cell recording identificou-se que além de seletividade ao receptor, que a aplicação do RNA ciclo 9- P2X4 promoveu inibição da corrente ativada pelo ATP somente nos receptores P2X4 e não em P2X2 em celulas 1321N1 astrocitoma transfectadas. A incubação do RNA ciclo 9-P2X4 na concentração de 200 nM com as células no estágio indiferenciado inibiu a formação dos corpos embriônicos. Já utilização de 25 nM, resultou em mudanças morfológicas nas células diferenciadas. Estes dados corroboram com os dados farmacológicos que identificaram a participação do receptor P2X4 na diferenciação precoce. Após 11 ciclos P2X2 de seleção, identificou-se sequências com especificidade de ligação aos receptores P2X2. Aptâmeros, moleculas de RNA com sequência identificada e com alta afinidade ao alvo da seleção, foram isolados de ambas as bibliotecas, ciclo 9 P2X4 e ciclo 11 P2X2. A co-aplicação destes aptâmeros e ATP em ensaios de whole-cell recording resultou na inibição de 30 a 80% da corrente ativada pelo ATP nos receptores P2X2 ou P2X4. Estes testes em células PC12 de rato, que expressa os receptores endógenos, resultou em inibição da corrente ativada pelo ATP de modo semelhante. Além de termos desenvolvido aptâmeros como ferramentas para elucidar as funções dos receptores P2X2 e P2X4 durante o desenvolvimento, diferenciação, em processos fisiológicos e patológicos, estas moléculas resistentes a nucleases são as primeiras identificadas capazes de reconhecer, discernir e inibir dois subtipos de receptores purinérgicos sendo promissores para utilização terapêutica.