Métodos para caracterização estrutural de Trypanosoma cruzi - Issa, Matheus (2025)
A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Ela persiste sem vacinas nem tratamento eficaz para a fase crônica e a quimioterapia disponível é dificultada por efeitos colaterais graves e baixa adesão dos pacientes. Os processos pelos quais o parasita adquire infectividade e sobrevive em diferentes hospedeiros envolvem a regulação da expressão gênica, principalmente de forma póstranscricional. Evidências emergentes sugerem que os mecanismos epigenéticos também desempenham um papel importante na biologia/patogênese desses parasitas, tornando os alvos epigenéticos candidatos adequados para a descoberta de drogas. Para tanto, a investigação da estrutura atômica das histonas e de seu complexo, o nucleossomo, é fundamental. Além disso, torna-se necessário efetuar, de maneira complementar, a caracterização estrutural das organelas que armazenam todo o genoma do parasita. Assim, este projeto tem, por finalidade, propor métodos para a caracterização estrutural de T. cruzi de modo a melhorar o entendimento da compactação e organização da cromatina, abrangendo técnicas de expressão e purificação das histonas para formação do nucleossomo e isolamento do complexo nativo direto do parasita. Com isso, objetiva-se determinar as estruturas dos complexos por Crio-Microscopia Eletrônica de Partícula Única. Ademais, o estabelecimento das técnicas de Ptychographic X-Ray Computed Tomography (PXCT) e Cryo-Soft X-Ray Tomography (Cryo-SXT) para a análise das estruturas celulares de T. cruzi em 3D permitirão o detalhamento das ultraestruturas da célula sem a introdução de artefatos decorrentes do emprego de cortes histológicos de técnicas tradicionais. Os resultados obtidos demonstram a viabilidade dos protocolos desenvolvidos para a obtenção e caracterização de nucleossomos de T. cruzi, bem como para obtenção de informações estruturais a partir das técnicas de PXCT e Cryo-SXT, algo inédito na literatura. No entanto, a necessidade de refinamento das condições de purificação e montagem dos complexos proteicos foi evidenciada, sendo essencial a implementação de ensaios complementares, como caracterizações biofísicas detalhadas. A continuidade desse trabalho inclui a análise estrutural de alta resolução por Crio-Microscopia Eletrônica de Partícula Única, visando a elucidação da estrutura atômica dos nucleossomos do parasita e sua relação com mecanismos epigenéticos de regulação gênica. As técnicas de tomografia de raios-X se mostraram muito úteis na determinação das ultraestruturas celulares, mas apresentam um limite de resolução que impossibilitam a determinação estrutural da organização da cromatina e de complexos proteicos ali presentes, algo que pode ser superado pela implementação de técnicas mais resolutivas, como Cryo-ET, e de softwares para segmentação automatizada das micrografias. Assim, a partir de uma abordagem embasada na Biologia Estrutural Integrativa proposta neste trabalho, os resultados aqui apresentados reforçam a necessidade de aprimoramento das técnicas utilizadas para, então, estruturar um conhecimento mais aprofundado sobre a biologia do parasita, que pode viabilizar pesquisas futuras para o desenvolvimento de novos fármacos contra a Doença de Chagas. Este projeto conta com a colaboração da Dra. Julia Pinheiro Chagas da Cunha, do Instituto Butantan, especialista no isolamento de histonas de T. cruzi e análise de modificações pós-traducionais.