Sequenciamento de transcritos completos e variantes de splicing da adrenal de cães - Fonseca, Vanessa Uemura da (2022)
Na nova era da genética, o mundo das “ômicas ” revela novas informações para compreensão desde o código genético até a função de proteínas no organismo. O transcriptoma é definido como um conjunto de todas as moléculas de RNA expressas em uma determinada célula ou tecido. Entre as diferentes plataformas moleculares, ganham destaque o sequenciamento de RNA por short reads, o chamado RNA-seq, e por long reads, denominado Iso-Seq. A complexidade dos organismos está relacionada com mecanismos que expandem a capacidade codificadora do genoma, neste contexto, o splicing alternativo é um dos mecanismos moleculares capazes de aumentar significativamente o repertório proteico de um organismo. No splicing alternativo, contrário do que ocorre no splicing constitutivo em que a sequência de RNAm é fiel ao gene, os íntrons do pré-RNAm podem sofrer processamento, dando origem a uma ou mais isoformas. Hipotetizamos que os genes HSD3B e CYP11B sintetizassem diferentes isoformas, cujas proteínas resultantes fossem a explicação para diferença na síntese de aldosterona e cortisol, bem como a diferente ação do trilostano nas zonas glomerulosa e fasciculada. Este projeto teve como objetivo principal caracterizar as isoformas das enzimas esteroidogênicas e de genes tumorigênicos no córtex adrenal de cães sem endocrinopatias e com endocrinopatia adrenal, diagnosticada como Síndrome de Cushing ACTH-independente. Esta tese apresenta dados da análise de sequenciamento de transcritos completos pelo Iso-Seq, baseado na tecnologia de Sequenciamento de Molécula Única em Tempo Real (SMRT) e dados complementares de RNA-seq do sequenciamento de córtex das glândulas adrenais de cães depositados em repositório público denominado Sequence Read Archive (SRA). Neste projeto foram sequenciados 4 córtex de glândulas adrenais não tumorais e 3 carcinomas adrenocorticais de cães. Foi demonstrado que há apenas um locus para o gene HSD3B e um locus para o gene CYP11B. Foi encontrado um grande número de isoformas para cada gene que codifica enzimas da cascata esteroidogênica. Os resultados foram filtrados pelo controle de qualidade nonsense-mediated RNA decay (NMD) e infere-se alta probabilidade de serem verdadeiras 96 isoformas dentre as 178 descritas do gene STAR, 11 isoformas verdadeiras de 33 descritas do gene CYP11A1, 1 isoforma verdadeira de 22 descritas do gene HSD3B, 14 isoformas verdadeiras de 74 descritas do gene CYP17A1, 14 isoformas verdadeiras de 48 descritas do gene CYP21A2, e 2 isoformas verdadeiras de 7 isoformas da CYP11B. Não há diferença significativa quanto a produção de isoformas dos genes SF-1, GNAS, PRKACA, PRKACB, PRKAR1A, PRKAR1B, TP53, MC2R, SOAT1 e CTNNB1 no tecido tumoral e não tumoral em cães. Conclui-se que o sequenciamento de transcritos completos pela técnica Iso-Seq pelo sistema PacBio forneceram informações novas para melhorar a anotação do genoma do cão e compreender o mecanismo de expansão da capacidade dos genes da cascata esteroidogênica gerarem diferentes enzimas.