Descoberta de potenciais biomarcadores da doença de Chagas em urina utilizando técnicas de espectrometria de massas. - Oliveira, Gilberto Santos de (2023)
A tripanossomíase americana, também conhecida como doença de Chagas (DC), continua sendo um importante problema de saúde pública na América Latina. A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi), e se apresenta em duas fases clínicas: aguda e crônica. A fase aguda é caracterizada por sintomas como febre, dor de cabeça e aumento do fígado, baço e gânglios linfáticos. Esses sintomas são frequentemente confundidos com outras doenças. Da fase aguda, 70-80% são assintomáticos (fase indeterminada), enquanto 20-30% desenvolvem sintomas durante a fase crônica da doença, que afetam o coração e o aparelho digestivo (megaesôfago e megacólon). As ferramentas diagnósticas disponíveis hoje para a fase aguda são baseadas principalmente em métodos parasitológicos. No entanto, devido aos sintomas inespecíficos, vários casos não são diagnosticados. Na fase crônica, os níveis do parasita circulante são baixos, e métodos sorológicos e moleculares têm sido propostos. Em países endêmicos, uma combinação de dois métodos sorológicos foi sugerida pela Organização Pan-Americana da Saúde para obter um diagnóstico conclusivo de DC. No entanto, ainda existem limitações na especificidade, sensibilidade e precisão. Devido a isso, novos marcadores são necessários para melhorar o diagnóstico atual da DC. Esta tese apresenta uma abordagem proteômica baseada em espectrometria de massa para identificar biomarcadores urinários de DC. Em particular, esta tese está dividida em dois capítulos principais: 1) a análise do proteoma da urina coletada de camundongos infectados com Trypanosoma cruzi durante as fases aguda, aguda tardia e crônica e 2) a análise do glicoproteoma da urina coletada de camundongos infectados com T. cruzi durante a fase aguda e aguda tardia. Cada capítulo é dividido em desenvolvimento e otimização do método seguido de aplicação na infecção por T. cruzi. O Capítulo I apresenta uma plataforma translacional para coletar urina de camundongos infectados e estudar o proteoma urinário. Este método foi aplicado para quantificar a abundância de proteínas urinárias de camundongos durante a infecção por T. cruzi nas fases aguda, aguda tardia e crônica. Nas fases aguda e tardia da infecção, ocorrem alterações nas proteínas do hospedeiro relacionadas à resposta inflamatória e do sistema imunológico e alterações na matriz extracelular dependente de colágeno. A ligação ao receptor, a atividade inibidora do receptor de acetilcolina e a atividade da endoprotease foram enriquecidas nas proteínas urinárias diferencialmente abundantes detectadas nas fases aguda e aguda tardia. Vários processos enriquecidos foram semelhantes na fase crônica, exceto para a ligação do receptor de partículas de HDL e ligação de esteroides/esterol. Outro resultado desse projeto foi a identificação de proteínas do T. cruzi secretadas na urina de camundongos infectados, como a proteína não caracterizada Q4E543, que passou na validação manual e poderá ser mais estudada como um potencial biomarcador. O Capítulo II apresenta a aplicação do método desenvolvido no Capítulo I e estende-o à análise do glicoproteoma urinário, olhando especificamente para os peptídeos De-N-glicosilados e N-glicopeptídeos intactos. Foram utilizados dois métodos de enriquecimento de glicopeptídeos, os métodos HILIC e TiO2. As glicoproteínas pertencentes aos componentes da matriz extracelular e de ligação aos glicosaminoglicanos foram enriquecidas conforme regulado na urina de camundongos infectados. Além disso, processos relacionados ao trato urinário, como o processo de filtração glomerular, foram identificados na análise de N-glicopeptídeos intactos, demonstrando a desregulação do rim . As tirosina quinases também foram identificadas na análise de N-glicopeptídeos intactos, destacando um importante papel dessas moléculas sinalizadoras durante a infecção por T. cruzi. Resultados anteriores mostraram que as tirosina quinases estão envolvidas no aumento da eficiência da invasão de células neuronais pelo T. cruzi. Outro achado interessante foi a identificação de duas glicoproteínas, proteína de adesão celular vascular 1 (Vcam-1) e Alfa-1-Microglobulina/Precursor da Bicunina (Ambp), respectivamente. Em particular, o Vcam-1 tem sido associado à infecção por T. cruzi na fase crônica, e o Ambp/bicunina está relacionado a processos inflamatórios associados a doenças renais e vasculares. Essas glicoproteínas foram identificadas nos conjuntos de dados de peptídeos De-N-glicosilados e N-glicopeptídeos intactos. Os resultados obtidos nesta tese ajudam a identificar processos biológicos alterados durante a infecção por T. cruzi e possíveis (glico)biomarcadores urinários da doença de Chagas.