Estudo dos efeitos do doador mitocondrial de sulfeto de hidrogênio (H2S) AP39 em células endoteliais humanas em cultura. - Marques, Leonardo André da Costa (2025)
Introdução: o papel fisiológico do sulfeto de hidrogênio (H2S) no controle da pressão arterial e angiogênese denota a relevância dos compostos doadores de H2S como uma alternativa multifacetada e inovadora à disfunção endotelial. O doador de H2S direcionado às mitocôndrias, AP39, mostra efeitos antioxidantes e de vasorelaxamento in vitro e in vivo, inclusive descritos pelo nosso grupo. Entretanto, seus mecanismos intracelulares ainda não foram totalmente elucidados. Objetivos: os objetivos do presente estudo foram explorar os mecanismos de sinalização intracelular dos efeitos vasculares do AP39 sobre células endoteliais. Metodologia: células endoteliais derivadas de veia umbilical humana (HUVECs) foram tratadas com os doadores de H2S direcionados às mitocôndrias AP39 e RT-01, com suas porções doadoras ADT-OH e RT-02, respectivamente, com molécula controle destes compostos, AP219, ou com o sal de sulfeto NaHS, testando-se a viabilidade e dano celular. A expressão das enzimas produtoras de H2S (CSE, CBS e 3MST) nestas células foi avaliada por western blotting. A capacidade de produção de H2S, bem como a avaliação das concentrações de H2S no sobrenadante celular após diversos tratamentos com inibidores enzimáticos, doadores de H2S ou de óxido nítrico (NO) foram avaliadas pelo método de formação de PbS e por técnica fluorimétrica baseada na interação entre o H2S e o reagente monobromobimano. A proliferação e migração celular em resposta aos diferentes doadores de H2S foram avaliadas pelo ensaio de ferida biplanar scratch wound; a produção de NO e mecanismos relacionados foi avaliada pela sonda fluorescente diaminofluoriceína. Ainda, o estresse mitocondrial e glicolítico foram avaliados com ensaios desempenhados na plataforma Agilent Seahorse® XFe96. Resultados: nenhum efeito tóxico às células foi observado em concentrações inferiores à 1 mM. No entanto, o AP39 à 100 nM, mas não suas porções controle, aumentou a redução do MTT após tratamento por 48 h (129,05±7,35%, **P<0,01) comparado ao controle (100%). O tratamento de HUVECs com concentrações crescentes do doador de NO nitroprussiato de sódio (NPS) diminuiu as concentrações de sulfetos totais no sobrenadante celular em até 56,20±0,65% e 58,05±6,45% após 4 e 24 h, respectivamente (***P<0,001). Todas as três enzimas produtoras de H2S foram detectadas em homogenatos de HUVECs. A produção de H2S pelos homogenatos de HUVECs avaliada pela formação de PbS foi totalmente inibida pelo AOAA 1 mM e parcialmente inibida pelo PAG 1 mM (37,1±8,35%, **P<0,01). Ainda, os tratamentos dos homogenatos com NPS 10 mM e 30 mM aumentaram a produção de H2S destes (155,8±8,5% e 281,5±0,8%, respectivamente; ***P<0,001), ao passo que o tratamento com NaHS a inibiu de maneira concentração-dependente (até 54,3±4,15%, *P<0,05). A proliferação celular induzida pelo VEGF a 1 mg/mL (77,45±6,85%) foi inibida na presença do L-NAME 100 mM (11,40±2,5%, ***P<0,001), 1 mM PAG (51,05±1,25%, *P<0,05) e pela combinação de ambos (24,35±3,70%, *P<0,05). Por outro lado, apesar dos compostos AP39 e ADT-OH à 30 nM não induzirem proliferação, estes induziram a migração celular após o tratamento com estes (33,85±8,65%, *P<0,05 e 37,35±3,25%, **P<0,01, respectivamente) de HUVECs. No estudo da produção de NO por HUVECs, observouse que a produção de NO induzida pela bradicinina (11,0±0,6 UAs. 106) foi inibida após pré-incubação com PAG 1 mM (8,25±0,20 UAs.106; ***P<0,001) e AOAA 0,1 mM (6,1±0,1 UAs.106; ***P<0,001). Por outro lado, o tratamento com 10 e 30 mM de NaHS induziu a produção de H2S (8,15±0,4 e 8,30±0,45 UAs.106, respectivamente; ***P<0,001). Neste caso, observou-se redução significante da produção de H2S induzida por NaHS 10 mM após o tratamento com L-NAME 100 mM (4,90±0,30 UAs.106; ***P<0,001), triciribina 5 mM (6,10±0,45 UAs.106; ***P<0,001), LY-29002 5 mM (6,80±0,10 UAs.106; *P<0,05), AOAA 0,1 mM (7,70±0,25 UAs.106; **P<0,01), PAG 1 mM (5,95±0,30 UAs.106; **P<0,01), TEA 1 mM (4,30±0,45 UAs.106; ***P<0,001), apamina 5 mM (5,65±0,30 UAs.106; ***P<0,001) e 4-AP 2 mM (5,40±0,05 UAs.106; ***P<0,001). Ainda, ambos doadores de H2S direcionados às mitocôndrias (AP39 e RT- 01 a 100 nM), bem como suas porções doadoras (ADT-OH e RT-02, respectivamente) a 100 nM induziram a produção de NO (AP39 = 6,20±0,25 UAs.106; ***P<0,001; RT- 01 = 5,60±0,15 UAs.106; ***P<0,001; ADT-OH = 5,55±0,15 UAs.106; *P<0,05; RT-02 = 5,40±0,05 UAs.106; *P<0,05). Entretanto, os mecanismos para a produção de NO induzida pelo AP39 à 100 nM foram identificados após inibição da produção de NO pelo tratamento com L-NAME 100 mM (4,60±0,25 UAs.106; ***P<0,001), apamina 5 mM (5,65±0,1 UAs.106; *P<0,05), tapsigargina 1 mM (5,60±0,20 UAs.106; *P<0,05), rotenona 0,1 mM (4,90±0,25 UAs.106; ***P<0,001), antimicina 1 mM (4,85±0,25 UAs.106; ***P<0,001) e oligomicina 1 mM (4,60±0,10 UAs.106; ***P<0,001). Quanto aos atributos mitocondriais, a respiração mitocondrial máxima (0,80±0,05 pmol/min/mg; *P<0,05), capacidade máxima (0,40±0,05 pmol/min/mg; **P<0,01) e consumo não mitocondrial de oxigênio (0,80±0,05 pmol/min/mg; ***P<0,001) de HUVECs tratadas AP39 100 nM foi aumentada comparada ao controle. Ainda, quando tratadas nesta mesma concentração, tanto a glicólise (485,10±8,95 mpH/min/mg; **P<0,01), quanto a capacidade glicolítica (388,10±8,75 mpH/min/mg; **P<0,01) foram diminuídas comparado ao controle. Conclusões: a produção endógena de H2S pelas HUVECs foi associada principalmente à atividade de CSE e alguns pontos de interação foram identificados nas vias de produção de H2S e NO nestas células. No entanto, a proliferação, migração celular e produção de NO induzidas pelo AP39 são o destaque deste trabalho. Observou-se maior potência nos efeitos do AP39 comparada aos induzidos por NaHS, além de mecanismos diferenciados, destacando a suplementação de H2S às mitocôndrias e vias de produção de NO independentes das citosólicas associadas ao NaHS. Neste caso, os efeitos mitocondriais do AP39 favoreceram a respiração mitocondrial e reduziu a capacidade glicolítica, possivelmente sugerindo o papel do Ca2+ intracelular e produção de NO derivada. Estes mecanismos mitocondriais inovadores por parte do AP39 representam uma nova abordagem na terapêutica das doenças vasculares, dada pela suplementação à produção deficitária de H2S e NO, mas também na reversão da disfunção mitocondrial mais recentemente descrita nas doenças vasculares.