Efeitos da melatonina na criopreservação do tecido ovariano - Shiroma, Marcos Eiji (2020)
INTRODUÇÃO: Os avanços no tratamento de câncer possibilitaram maior sobrevida às pacientes. Consequentemente, novas técnicas que permitam a manutenção da fertilidade dessas mulheres são estudadas e algumas permanecem em caráter experimental, como o transplante de ovário, que ainda apresenta limitações na qualidade do tecido criopreservado depois do descongelamento. A melatonina é uma indolamina com potente propriedade anti-oxidante cujos efeitos tem sido estudados em transplante de diversos órgãos. OBJETIVO: Avaliar os efeitos da melatonina na criopreservação do tecido ovariano de ratas: avaliação funcional pela retomada do ciclo estral após transplante; macroscopia, histomorfometria e imunoistoquímica do enxerto. MATERIAIS E MÉTODOS: Vinte e seis ratas Wistar adultas, com cerca de três meses de idade e ciclos estrais regulares foram distribuídas, randomicamente, em dois grupos com 13 animais em cada: 1) grupo controle: ovários criopreservados com meio M2 de cultura celular e crioprotetor dimetilsulfóxido (DMSO); e 2) grupo melatonina: ovários criopreservados com meio M2, DMSO e melatonina. Os ovários foram mantidos em nitrogênio líquido por 24h e, em seguida, realizou-se transplante autólogo e avascular dos ovários íntegros em retroperitônio. Em outros três animais de cada grupo, os ovários foram analisados imediatamente após o descongelamento, para avaliar os possíveis efeitos causados pela criopreservação. A partir do 15o dia de pós-operatório (PO), coletaram-se esfregaços vaginais diários corados pela técnica de Shorr-Harris para caracterização do ciclo estral. Entre o 30o e 35o dia de PO, os animais foram submetidos à eutanásia sempre na fase diestro do ciclo estral. Os enxertos ovarianos foram identificados, ressecados e armazenados. Realizaram-se as seguintes análises: 1) histomorfológica; 2) histomorfométrica (classificação e contagem de folículos ovarianos e corpos lúteos); 3) quantificação de colágeno no estroma do ovário (Picrosirius); 4) imunoistoquímica para proliferação celular (Ki-67), apoptose (caspase-3 clivada, TUNEL), angiogênese (fator - von Willebrand) e expressão hormonal (receptor para estrogênio e progesterona). RESULTADOS: No grupo de ratas cujos enxertos ovarianos foram analisados logo após o descongelamento, não se observou diferença estatisticamente significativa do grupo melatonina em relação ao controle com relação a folículos imaturos (4,66 ± 0,88 x 10,33 ± 2,90; p=0,13), folículos maduros (5,33 ± 1,20 x 11,00 ± 3,51; p=0,20), corpos lúteos (10,33 ± 4,70 x 10,00 ± 3,46; p=0,95), vasos sanguíneos (2,66 ± 1,76 x 4,66 ± 1,45; p=0,43), expressão de caspase em estroma (1,95 ± 0,33 x 1,61 ± 0,32; p=0,48), caspase em folículos (2,37 ± 0,33 x 3,39 ± 0,75; p=0,18), TUNEL em estroma (0,21 ± 0,09 x 0,05 ± 0,01; p=0,05) e TUNEL em folículos (0,07 ± 0,01 x 0,04 ± 0,01; p=0,26). No grupo de ratas cujos enxertos ovarianos foram analisados após 30 a 35 dias do transplante, todos os animais apresentaram fase estral do ciclo estral, sendo mais precoce no grupo melatonina (16,22 ± 0,50 x 20,75 ± 1,89; p=0,0017). Os folículos ovarianos viáveis estavam em diversos estágios de desenvolvimento e os corpos lúteos, intactos. O grupo melatonina, em relação ao grupo controle, apresentou aumento em: folículos maduros (8,75 ± 2,02 x 3,01 ± 0,91; p=0,04), colágeno tipo I (8,52 ± 1,04 x 5,75 ± 0,52; p=0,03), células endoteliais (fator de von Willebrand) (3,20 ± 0,38 x 1,69 ± 0,28; p=0,003), proliferação celular por Ki67 tanto em folículos (4,09 ± 0,55 x 1,46 ± 0,29; p=0,002) como corpos lúteos (5,27 ± 0,54 x 1,67 ± 0,33; p < 0,001), receptores de estrogênio em folículos (5,37 ± 0,73 x 2,41 ± 0,93; p=0,02), corpos lúteos (6,43 ± 0,85 x 2,25 ± 0,38; p < 0,001) e apoptose por caspase em corpos lúteos (24,50 ± 2,06 x 5,88 ± 0,82; p < 0,001). O grupo melatonina, em relação ao controle, revelou redução em colágeno tipo III (1,49 ± 0,15 x 3,53 ± 0,28; p < 0,001) e apoptose pelo método TUNEL em folículos (0,04 ± 0,02 x 0,40 ± 0,14; p < 0,001) e corpos lúteos (0,10 ± 0,03 x 1,58 ± 0,23; p < 0,001). Não houve diferença estatisticamente significativa no grupo melatonina em relação ao controle em número de folículos imaturos (6,00 ± 2,55 x 7,20 ± 3,23; p=0,66), corpos lúteos (5,22 ± 1,05 x 7,86 ± 1,71; p=0,34) e apoptose representada pela caspase 3 clivada em folículos (13,70 ± 1,79 x 11,30 ± 1,87; p=0,38) nem em receptores de progesterona em folículos (4,65 ± 1,13 x 4,26 ± 0,53; p=0,77) ou corpos lúteos (13,47 ± 1,72 x 16,62 ± 1,07; p=0,14). CONCLUSÃO: O emprego da melatonina na solução de criopreservação aparenta melhorar a qualidade do tecido ovariano preservado, em parâmetros funcionais, histológicos e imunoistoquímicos