Validação da PCR multiplex na detecção e identificação de Candida spp. em infecções de corrente sanguínea de pacientes pediátricos gravemente doentes - Taira, Cleison Ledesma (2013)
A ocorrência de candidemias em pacientes internados em unidades de cuidados intensivos é um grave problema por estar relacionada a elevadas taxas de mortalidade. Sinais e sintomas de infecção hematogênica causada por Candida sp. são inespecíficos, dificultando o diagnóstico e representando um desafio para o desenvolvimento de métodos diagnósticos que identifiquem precocemente o agente em amostras clínicas. As metodologias tradicionais (hemocultura e identificação fenotípica) e sorológicas (detecção de beta-D-glucana, manana e anticorpos anti-manana) apresentam limitações de sensibilidade e especificidade, sendo os métodos moleculares uma alternativa para o diagnóstico dessas infecções. Neste trabalho foi desenvolvida uma técnica de nested PCR multiplex capaz de identificar sete espécies de Candida (C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. lusitaniae e C. pelliculosa) diretamente em amostras sanguíneas de pacientes com elevado risco de desenvolver candidemias. Na primeira etapa de amplificação foram utilizados primers universais para fungos (ITS1 e ITS4); e na segunda, os primers espécie-específicos foram distribuídos em dois sistemas de amplificação, a saber: um com primers para C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C. lusitaniae; e outro com primers para C. parapsilosis, C. krusei e C. pelliculosa. A nested PCR multiplex foi capaz de detectar cerca de 4UFC/mL das espécies envolvidas no estudo, não apresentando reatividade cruzada quando avaliada com amostras de DNA de outros fungos e bactérias envolvidos em episódios de infecção hematogênica. Foram analisadas 55 amostras obtidas de pacientes pediátricos internados em unidades de cuidados intensivos do Instituto da Criança do HC-FMUSP e do Hospital de Base da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - UNESP, com idades variando de seis dias a 16 anos, apresentando Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica e/ou dois ou mais fatores de risco para infecção fúngica. Também foi avaliado no estudo um grupo controle, composto por 28 crianças sem risco de desenvolver fungemias, para verificação da ocorrência de possíveis reações inespecíficas pela técnica molecular. As hemoculturas foram positivas em oito pacientes (14,8%), tendo sido identificadas cinco C. albicans, uma C. tropicalis, uma C. parapsilosis e uma C. krusei. Por outro lado, a técnica de nested PCR multiplex detectou DNA de Candida em 13 pacientes (23,6%), tendo havido concordância na identificação das espécies em 100% dos casos. Entretanto, não foi observada discordância estatisticamente significativa (p=0,063) entre as duas metodologias. Dos cinco pacientes com hemoculturas negativas, a técnica molecular foi capaz de detectar dupla candidemia em três casos, identificando nessas amostras C. tropicalis e C. parapsilosis simultaneamente. Nos cinco casos em que apenas a técnica de PCR foi positiva, as amostras amplificadas foram sequenciadas, apresentando similaridades de 99 a 100%, quando comparadas às sequencias de cepas de Candida depositadas no GenBank. O tempo para execução da técnica e liberação de resultados foi de aproximadamente 24 horas. O custo relativo aos procedimentos realizados para execução da PCR foi calculado e comparado ao custo dos procedimentos executados nas hemoculturas, tendo sido mais baixo. Os resultados demonstram que a nested PCR multiplex é técnica alternativa para a detecção e identificação de espécies de Candida em pacientes com risco de desenvolver candidemias, apresentando limiar de detecção adequado e capacidade de identificar mais de uma espécie de Candida simultaneamente em amostras clínicas. A técnica é ainda capaz de permitir a liberação de resultados em menor tempo, além de apresentar menor custo, quando comparada à metodologia convencional de cultivo