Caracterização do sistema de secreção do tipo II de Chromobacterium violaceum - Barroso, Kelly Cristina Martins (2022)
Bactérias usam sofisticadas nanomaquinarias para secreção de proteínas através do envelope celular. O sistema de secreção do tipo II (T2SS) transloca via periplasma proteínas que atuam como toxinas e enzimas hidrolíticas extracelulares. Neste trabalho, caracterizamos o T2SS de Chromobacterium violaceum, uma bactéria Gramnegativa que pode atuar como um patógeno oportunista em humanos. O T2SS de C. violaceum é codificado por 13 genes (operon gspCDEFGHIJKLMN e pilD). A atividade promotora do operon gsp do T2SS aumentou na presença de sais biliares e na transição da fase logarítmica para a fase estacionária. A aumentada expressão em alta densidade celular não foi dependente do sistema de quorum sensing CviIR. Foram obtidas quatro linhagens mutantes do T2SS, com deleção dos genes gspD (secretina), gspE (ATPase), pilD (prepilina peptidase) e gspC-N (deleção de todo o operon gsp). Curvas de crescimento, contagem de UFCs e ensaios de live/dead e microscopia eletrônica revelaram que as linhagens mutantes T2SS têm atraso de crescimento e drástica redução de viabilidade em culturas de fase estacionária. Os mutantes T2SS apresentaram comprometimento da membrana externa, como demonstrado por curvas de crescimento na presença do antibiótico polimixina B e ensaios de permeabilidade ao brometo de etídio. O mutante duplo ΔgspDΔcviI teve melhora de fitness, sugerindo que proteínas reguladas pelo sistema de quorum sensing CviIR acumulariam no periplasma e prejudicariam o fitness dos mutantes T2SS em alta densidade celular. Os ensaios de atividade hidrolítica em placa, realizados em meio M9 suplementado com substratos específicos, revelaram que todos os mutantes T2SS apresentaram atividade diminuída de protease, gelatinase, quitinase e hemolisina. Os halos de atividade proteolítica da linhagem selvagem diminuíram na presença do agente quelante de metais EDTA, indicando que C. violaceum secreta metaloproteases via T2SS. Análise quantitativa por espectrometria de massas comparando os exoproteomas da linhagem selvagem e do mutante ΔgspD permitiram a identificação várias enzimas hidrolíticas secretadas pelo T2SS de C. violaceum, incluindo proteases, colagenases, quitinases e lecitinase. Para caracterizar alguns substratos secretados pelo T2SS de C. violaceum, foram obtidas as linhagens mutantes ΔCV_2001 e ΔCV_3255 (colagenases), ΔCV_2571 e ΔCV_0057 (proteases), ΔCV_1440 e ΔCV_3931 (quitinases) e ΔCV_0362 (hemolisina/lecitinase). As curvas de crescimento em meio LB mostraram que essas linhagens mutantes não têm problemas de crescimento. Em relação a produção de biofilme, apenas o mutante ΔCV_2571 teve o biofilme reduzido. Nos ensaios de atividade hidrolítica em placa, apenas o ΔCV_0362 teve redução do halo de lecitinase/lipase. Os ensaios de virulência em camundongos com estes sete mutantes indicaram nenhuma ou fraca atenuação de virulência, sugerindo que as enzimas secretadas pelo T2SS podem ter papel redundante. Em conjunto, os resultados deste trabalho indicam que C. violaceum expressa um T2SS funcional que é necessário para a secreção de diversas enzimas hidrolíticas extracelulares.