Produção de vetores lentivirais em condições escalonáveis para geração de células T-CAR para terapia celular - Tirapelle, Mariane Cariati (2021)
Os vetores lentivirais são muito utilizados como vetores para a modificação gênica em terapias celular e gênica como as que empregam células T-CAR, devido a sua estabilidade de integração no genoma das células, eficiência de transdução e segurança. A produção destes vetores em cultivos em monocamada em meios contendo soro fetal bovino (SFB), tradicionalmente empregada na academia e centros de pesquisa, possui uma série de limitações, dentre elas a incompatibilidade com uma produção de forma mais controlada em maiores escalas, sendo desejável para isto o cultivo celular em suspensão em biorreatores. O objetivo deste projeto foi produzir partículas lentivirais em condições escalonáveis, utilizando células adaptadas para crescimento em suspensão em meio de cultura livre de soro fetal bovino (SFB). Portanto, células da linhagem HEK293T, adaptadas ao cultivo em suspensão, foram utilizadas para produção de partículas lentivirais que expressam a proteína sintética CAR anti-CD19 assim como IL-18 e GFP. A primeira etapa consistiu em produzir partículas lentivirais em monocamada em meio contendo SFB como condição controle e avaliar sua funcionalidade. Em monocamada a produção média, em 48 horas, foi de 8x106 partículas/mL. A funcionalidade do vetor foi avaliada por meio da modificação de linfócitos T para expressão da molécula CAR. Os resultados indicaram que o vetor é capaz de induzir resposta antitumoral nos linfócitos T, que por sua vez foram capazes de identificar e levar a morte células CD19 positivas in vitro. As células HEK293T adaptadas tiveram seu perfil cinético e metabólico caracterizado, tendo sido obtidos resultados satisfatórios com e sem suplementação com Cellboost. A presença deste componente, no entanto, inibiu a transfecção transiente e por conseguinte a produção de partículas lentivirais. Mesmo na ausência de Cellboost, a produção lentiviral em suspensão sem SFB apresentou resultados inferiores quando comparados com a produção em monocamada em meio suplementado com SFB. Por meio de Design de Experimentos (DoE) - Box-Behnken foi realizada uma otimização do protocolo de transfecção. Os resultados mostraram que a melhor condição envolveu a utilização de 1 μg de DNA/106 células, 1x106 células/mL e proporção PEI:DNA de 2,5:1. Este protocolo foi otimizado com a adição de Butirato de Sódio a 5mM e a produção obtida foi maior, em média, 1,5x105 partículas/mL. No presente trabalho foi possível realizar a otimização do protocolo de produção de partículas lentivirais em suspensão em meios livres de SFB mantendo as mesmas funcionais e capazes de induzir resposta antitumoral in vitro.