Caracterização da interação entre a nucleofosmina e a proteína de matriz do Vírus Sincicial Respiratório Humano e suas implicações na replicação viral - Barbosa, Ana Beatriz Ruiz Afonso (2022)
O Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) está entre os patógenos mais importantes do trato respiratório. Esse vírus causa doença respiratória principalmente em recém-nascidos, bebês, crianças, idosos e pacientes imunocomprometidos. Até o presente não há antiviral eficiente ou vacina aprovada. O genoma do hRSV codifica 11 proteínas, sendo elas de extrema importância para o entendimento da relação vírus-hospedeiro. Em trabalhos anteriores do laboratório foram analisadas as interações das proteínas virais Nucleoproteína (N), Fosfoproteína (P) e Matriz (M) com proteínas celulares, tanto pela expressão individual dessas proteínas virais transfectando vetores plasmidiais, quanto no contexto de infecção. Verificou-se que N interage com as proteínas celulares Hsp70, PRMT5 e WDR77; P interage com Hsp70 e com Tropomiosina; e M com Nucleofosmina (NPM1) e Tropomiosina. Neste projeto temos por objetivo caracterizar a interação da proteína de Matriz do hRSV com NPM1, além de buscar possíveis implicações funcionais para a replicação do vírus. A proteína de M tem sido implicada com a montagem e brotamento da partícula viral, além da inibição da transcrição do genoma viral e de genes celulares. No início da infecção, a proteína M localiza-se no núcleo da célula hospedeira, onde postulávamos ocorrer a interação com a NPM1, proteína originalmente nucleolar, multifuncional, com capacidade de transitar entre o nucléolo, núcleo e citoplasma. Assim, propusemos confirmar tal interação e analisar, em diferentes fases da replicação viral, a distribuição intracelular de ambas as proteínas. Fizemos ensaios funcionais, avaliando a replicação do vírus após inibição de NPM1, e observamos a ação de um inibidor da oligomerização de NPM1 na replicação viral. Os resultados mostraram que a NPM1 não mudou sua redistribuição em células infectadas pelo hRSV, permanecendo nucleolar e nucleoplasmática, assim como em células não infectadas, além de não observarmos pontos de co-localização entre M e NPM1 por imunofluorescência confocal. O mesmo foi visto ao transfectarmos vetor de expressão para a proteína M. Em estudos de fracionamento celular de células infectadas, observamos indícios de um aumento de NPM1 para o nucleoplasma e para a cromatina em células infectadas. No entanto, em fracionamento de células expressando apenas M, não observamos o mesmo padrão. A partir de um shRNA direcionado contra mRNA de NPM1, foi possível observar a diminuição da expressão de fosfoproteína P em células infectadas, mesmo padrão observado ao tratar as células com um inibidor da oligomerização da NPM1 (NSC348884). Tratamento com este inibidor também teve a capacidade de prejudicar a síntese global de proteínas virais. Tais resultados sugerem que a NPM1 interfira no ciclo replicativo do hRSV.