Tipagem molecular de Toxoplasma gondii: análise de líquidos amnióticos de gestações com diagnóstico de toxoplasmose congênita - Souza, Mariana Vitule Brito de (2009)
Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose, podendo causar diferentes formas da doença, entre elas, a toxoplasmose congênita cuja frequência varia significativamente de acordo com o país estudado. Na França, foi estimada em 1-3 casos/1.000 nativivos, enquanto nos EUA cerca de 1/10.000, porém não existem estimativas da prevalência de infecção congênita no Brasil. Toxoplasma gondii possui três linhagens clonais conhecidas como genótipos I, II e III que se relacionam aos três tipos descritos de acordo com a classificação da patogenicidade do parasita em camundongos, estando os três tipos associados a infecções humanas de maior patogenicidade, menor patogenicidade e patogenicidade intermediária, respectivamente. Os três genótipos já foram identificados na América do Norte e Europa, sendo o genótipo II predominante em infecções congênitas. O presente estudo teve como objetivo determinar a freqüência dos genótipos I, II e III de T. gondii em 85 amostras de líquido amniótico de gestantes brasileiras com toxoplasmose confirmada e adquirida durante a gestação, todas oriundas de São Paulo. Para tal, foi utilizada a técnica de multiplexnested- PCR-RFLP com amplificação simultânea de quatro fragmentos pertencentes a três genes do parasita: 3-SAG2, 5-SAG2, SAG3 e GRA6 Das 85 amostras iniciais, 76 foram positivas pelo sistema de multiplexnested- PCR (92,7%), tendo sido possível analisar o maior número de amostras no sistema que amplifica a região do gene SAG3 (69,7%), seguido do sistema 3-SAG2 (44,7%), do sistema 5-SAG2 (40,8%), e finalmente do sistema GRA6 (25%). Nas 76 amostras submetidas à genotipagem foram encontrados: 1,3% (1 amostra) do genótipo I; 71,1% (54 amostras) do genótipo II; 6,6% (5 amostras) do genótipo III; e 21% (16 amostras) para as quais não foi possível definir o genótipo parasitário após clivagem enzimática, tendo sido as mesmas submetidas ao sequenciamento. Das 16 amostras, duas não puderam seqüenciadas por falta de DNA remanescente e das 14 analisadas: duas foram definidas como tipo III, apresentando 100% de homologia com o protótipo VEG, e duas foram definidas como tipo II apresentando 100% de homologia com o protótipo ME49. Em 10 amostras foram observadas misturas de duas ou mais bases, em uma ou mais posições nucleotídicas da sequência de DNA do fragmento amplificado, sendo identificadas como recombinantes. Além disso, seis amostras identificadas pela técnica de multiplex-nested-PCR-RFLP como tipo II foram selecionadas aleatoriamente para a confirmação dos resultados e, em quatro das seis amostras, foi observada mistura de bases em outras posições nucleotídicas do fragmento amplificado, regiões estas não analisadas pela RFLP. A técnica de multiplex-nested-PCR seguida de RFLP mostrou-se útil, porém apresenta limitações no que se refere à genotipagem de amostras de líquido amniótico, uma vez que, após sequenciamento, foram reveladas várias recombinações genéticas nos fragmentos amplificados que haviam sido previamente identificados como tipo II. Sendo assim, sugerimos que, a genotipagem de T. gondii, diretamente de amostras biológicas ou após isolamento do parasita deva ser realizada pela amplificação de múltiplos genes de T. gondii e sequenciamento de todos os fragmentos amplificados