IIdentificação e caracterização de proteínas de superfície da família SRS do Apicomplexa Neospora caninum - Bezerra, Marcos Alexandre (2017)
Neospora caninum é um parasita intracelular obrigatório do filo Apicomplexa, intimamente relacionado a Toxoplasma gondii e responsável por abortamento e perda da fertilidade em bovinos, o que acarreta prejuízos significativos na pecuária mundial. Como parte de seu ciclo intracelular, a primeira interação do parasita com a célula alvo é realizada por proteínas de superfície conhecidas como superfamília SRS (Surface Antigen Glycoprotein - Related Sequences). Proteínas SRS ou SAG tem sido alvo de intensas pesquisas devido ao seu padrão imunodominante, exibindo grande potencial como ferramenta de diagnóstico e/ou candidatos vacinais. Atualmente existem cinco genes pertencentes à extensa família de proteínas SRSs descritos na literatura científica para N. caninum, dos quais dois foram caracterizados de taquizoítas por serem altamente reconhecidos por soros de animais infectados: NcSRS29B (SAG1) e NcSRS29C (SRS2). Diante disso, este trabalho foi realizado com o objetivo de caracterizar as proteínas de superfície SRS, NcSRS57 e NcSRS67. Além disso, foi obtido um panorama geral de proteínas ancoradas por GPI de N. caninum na linhagem Nc-1. Dentre os homólogos apicomplexas, NcSRS67 apresentou maior identidade e similaridade com Hammondia hammondi (HHA_450490), enquanto NcSRS57 revelou maior identidade e similaridade com Toxoplasma gondii (TgSRS57). NcSRS67 e NcSRS57 apresentaram a terceira maior semelhança entre os homólogos envolvidos no alinhamento estrutural. Estas duas proteínas SRS possuem doze resíduos de cisteína conservados que por predição formam seis pontes dissulfeto distribuídas em dois domínios SRS (D1 e D2), formando sanduiches de folhas ? e ? hélices associadas entre si. A sequência codificadora de NcSRS67 (sem o peptídeo sinal e sem a âncora GPI) foi clonada e expressa constitutivamente no plasmídeo pCR-Blunt II-TOPO-His6x. A forma nativa de NcSRS67 apresentou massa molecular de 35 kDa (predito 30.6 kDa sem peptídeo sinal e sem âncora GPI). A sequência rNcSRS57 (sem o peptídeo sinal e sem a âncora GPI) foi clonada em pET32, entretanto apenas um fragmento de 92 pb foi traduzido em relação a sequência clonada de 1074pb, devido a presença de stop códon oculto. Este evento gerou rNcSRS57 com massa molecular abaixo do esperado (19,5 kDa). NcSRS57 nativa apresentou massa de 43 kDa (predito sem peptídeo sinal e sem âncora GPI 31.14 kDa). Os efeitos inibitórios dos anticorpos policlonais anti-rNcSRS67, anti-rNcSRS57 e a associação destes sobre a adesão/invasão de taquizoítas foram investigados in vitro, resultando em uma inibição de 20% para o anticorpo anti-rNcSRS67, 16% para o anticorpo anti-rNcSRS57 e 11% para a associação destes dois anticorpos. NcSRS67 foi localizada sobre parte da superfície de taquizoítas, ao contrário de NcSRS57, que abrangeu toda a área da superfície destes parasitas. Apesar das inúmeras tentativas, as formas nativas de NcSRS67 e NcSRS57 obtidas por eletroforese 2D não foram identificadas por MS/MS. O tratamento de taquizoítas de N. caninum com a enzima fosfolipase C fosfatidilinositol (PI-PLC) específica, seguido de análises por MS/MS também gerou a identificação de proteínas de N. caninum, ii dentre elas as proteínas mais abundantes já identificadas no secretoma de N. caninum, NcSRS29B (SAG1) e NcSRS29C (SRS2). Dessa forma, os resultados obtidos neste estudo agregam conhecimentos sobre o parasita N. caninum e revelam-se úteis na busca e seleção de novos alvos a serem investigados contra a neosporose.