Clonagem, expressão heteróloga e caracterização da proteína de escolta da Hsp70 de Leishmania braziliensis - Silva, Sabrina Matos de Oliveira da (2011)
A Leishmaniose é uma doença infecciosa causada por protozoários flagelados do gênero Leishmania. Os parasitas como a Leishmania braziliensis, sofrem várias mudanças morfológicas durante seu ciclo de vida, incluindo a troca de organismo hospedeiro. Durante essas mudanças, proteínas de choque térmico ou chaperones moleculares, como, por exemplo, a Hsp70, são expressas em grande quantidade. A função da Hsp70 é auxiliar no processo de enovelamento protéico, no transporte de proteínas entre as membranas e em muitas outras importantes funções celulares. A Hsp70 é auxiliada por várias proteínas denominadas como co-chaperone e a Hep1 (do inglês Hsp70-escort protein 1) é uma delas. Essa co-chaperone tem seu papel descrito principalmente em mitocôndrias como estabilizadoras da Hsp70 capazes de prevenir a sua agregação. O objetivo deste trabalho foi clonar, expressar, purificar e caracterizar as proteínas Hsp70 e Hep1 de L. braziliensis (LbHsp70 e LbHep1). Os ensaios preliminares mostraram que a LbHsp70 foi expressa de forma insolúvel, sendo necessário expressar a proteína em corpos de inclusão para tentativas de reenovelamento, afim de obter a mesma na fração solúvel. Apesar da LbHsp70 se apresentar na fração solúvel após o reenovelamento, a mesma foi purificada como agregado. Ainda na tentativa de obter a LbHsp70 na forma solúvel, a mesma foi co-expressa com a LbHep1 (expressa na forma solúvel), porém a LbHsp70 continuou na fração insolúvel do lisado bacteriano. Como a LbHep1 não apresentou a atividade esperada quando co-expressa com a LbHsp70 citoplasmática, foram feitos ensaios de co-expressão da LbHep1 com a Hsp70 mitocondrial humana, que é heterologamente expressa na forma de agregados, com o intuito de confirmar a atividade estabilizadora das Hep1 sobre as Hsp70 mitocondriais. Este experimento possibilitou a obtenção de ambas proteínas na fração solúvel, de acordo com dados apresentados na literatura para este sistema em outros organismos. Uma vez mostrada à funcionalidade da LbHep1, foi feita a caracterização desta proteína por métodos biofísicos como dicroísmo circular, espectrometria de fluorescência, cromatografia de exclusão molecular analítica e ultracentrifugação analítica. Os experimentos mostraram que a LbHep1 apresenta estrutura secundária composta principalmente de folhas-β pregueadas e que o único triptofano está parcialmente exposto ao solvente. As análises hidrodinâmicas mostraram que a LbHep1 é assimétrica e em equilíbrio entre monômeros e dímeros. Por fim, dados de ultracentrifugação analítica indicam que a LbHep1 está em equilíbrio monômero-dímero.