Investigação estrutural e termodinâmica de proteínas multi-domínios por SAXS, RMN, DM e ITC - Souza, Maximilia Frazão de (2020)
Proteínas representam o maior número de macromoléculas nos mais diversos organismos, sendo responsáveis por uma grande diversidade de funções biológicas. Cada proteína é única e apresenta atividade característica. O entendimento estrutural e da dinâmica associada a essas estruturas é essencial para a compreensão do sistema celular, no estudo de quadros patológicos, assim como no desenvolvimento de fármacos. A investigação estrutural de proteínas é uma esfera desa adora devido à complexidade das estruturas. As ferramentas utilizadas para a determinação da estrutura tridimensional contemplam experimentos computacionais, cálculo estrutural e técnicas experimentais. Limitações estão presentes nas diversas abordagens, contudo, uma das principais ferramentas para maximizar as informações é a combinação e correlação de dados por diversas fontes de análise. Neste trabalho aplicaram-se diferentes técnicas experimentais e modelagem para o estudo de proteínas em solução. Destes, citam-se: investigação estrutural e dinâmica por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) e espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS), modelagem estrutural com diferentes abordagens (modelagem por: homologia, corpos rígidos, ab initio e dinâmica molecular) e análise do mecanismo de interação proteína-ligante com dados de calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Uma análise estrutural foi realizada por SAXS para diversas classes de peroxirredoxinas (Prx), que são enzimas que atuam na decomposição de peróxidos através de cisteínas altamente reativas. A regulação das Prxs em função do estado oligomérico é um aspecto pouco compreendido. Neste estudo avaliou-se a dependência do estado oligomérico como função do estado redox. A análise dos resultados mostrou que o arranjo da estrutura quaternária da Prx3 humana depende do estado de oxidação. Modelos ab initio de baixa resolução e parâmetros estruturais por SAXS possibilitaram a determinação e análise de estruturas das Prxs, até então desconhecidas. De forma geral, a técnica de SAXS se mostrou uma excelente ferramenta na investigação estrutural de Prxs 1-Cys e 2-Cys típicas. Nesta tese, realizou-se também uma investigação estrutural e da dinâmica dos domínios sensores de Ca2+ intracelular (CBD1 e CBD2) do trocador Na+/Ca2+ de Drosophila (CALX). Os dois CBDs estão dispostos adjacentemente um em relação ao outro, e conectados por um curto linker em uma construção chamada CBD12. O trocador é um dos principais mecanismos de manutenção da concentração de Ca2+ intracelular em células excitáveis. Com o objetivo de obter informações sobre o mecanismo de inibição do CALX por Ca2+ intracelular, a dinâmica de CBD12 na ausência e presença de Ca2+ foi investigada por simulações de dinâmica molecular (DM), SAXS e análise de dados de acoplamento dipolar residual (RDC). Além disso, o mecanismo de ligação de Ca2+ nos CBDs foi investigado por RMNeITC. A combinação de DM, SAXS e RDC possibilitou a determinação atomística de umensemble de conformações de CBD12 na ausência e na presença de Ca2+, mostrando que na presença de Ca2+ ocorre o deslocamento do ensemble para populações de arranjo estendido. Esta análise possibilitou a primeira descrição atomística de CALX-CBD12 no estado Apo. Experimentos de titulação por calorimetria mostraram que CBD2 não liga Ca2+, no entanto, CBD1 liga a quatro íons Ca2+ com alta cooperatividade. De forma geral, as análises realizadas enfatizaram a vasta gama de aplicações da técnica de SAXS e a importância da integração de diferentes técnicas biofísicas para o estudo de proteínas exíveis, principalmente, sistemas multi-domínios.