Estudo de protocolos de extração e caracterização química de polissacarídeo de parede celular e polissacarídeo intracelular de biofilme patogênico de Streptococcus mutans - Ré, Ana Carolina dos Santos (2022)
Streptococcus mutans é um dos microrganismos relacionados ao desenvolvimento da cárie dental, produzindo o biofilme, uma estrutura tridimensional complexa composta principalmente por polissacarídeos, que podem ser classificados como: i) polissacarídeos extracelulares, dispersos por toda a matriz, protegendo bactérias especialmente de compostos antimicrobianos; ii) polissacarídeos de parede celular contendo raminose (PRAM) ancorados ao peptidoglicano, essenciais para a virulência bacteriana e iii) polissacarídeos intracelulares (PIC), polímeros estocados no interior da célula, atuando como reserva energética. Em contraste com os polissacarídeos extracelulares, a determinação da estrutura química e o estabelecimento de um protocolo para a extração do PRAM e do PIC ainda é um desafio e não está estabelecida na literatura. Assim, considerando a importância biológica dos PRAM e dos PIC, o objetivo deste trabalho foi avaliar um protocolo de extração destes polímeros e suas características estruturais a partir de biofilme de S. mutans. Biofilmes de S. mutans UA159 foram formados em lâminas de vidro por 5 dias, sendo coletados e processados para a retirada da matriz microbiana, composta por polímeros extracelulares. As células bacterianas resultantes foram submetidas a parâmetro químico (extração alcalina a quente com NaOH 0,5M ou 1M por 5, 10 ou 15 minutos a 100 °C) ou físico (sonicação com 1 pulso de 15 s com potência de 5W ou 20W em água ou solução salina) para obtenção dos polissacarídeos de parede celular e dos polissacarídeos intracelulares. Após hidrólise ácida (ácido trifluoracético por 8 horas a 100 °C), a composição monossacarídica de todos os grupos experimentais foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência associada a detector de índice de refração, sendo o protocolo de extração com NaOH 1M a 100 °C por 15 minutos selecionado para a caracterização química das estruturas, utilizando-se ressonância magnética nuclear (RMN). Os resultados sugerem que enquanto o PIC é um polissacarídeo de glucanas com cadeia principal α-(1→4) ligado com cadeias laterais ramificadas α-(1→6), o PRAM é uma ramnoglucana com cadeia principal α-(1→2) e α-(1→3) de raminose e cadeias laterais de glucose ligadas por α-(1→2), sendo ambas as estruturas estudadas pela primeira vez em uma única fração. Assim, a partir de um único homogenato alcalino obtido de biofilme cariogênico foi possível esclarecer a estrutura química por RMN de duas moléculas: i) o polissacarídeo de parede celular, que pode ser a chave para o desenho de futuros alvos terapêuticos para antimicrobianos no futuro e ii) o polissacarídeo intracelular, que pode contribuir para um maior entendimento da rota metabólica de carboidratos em S. mutans.