Isolamento de uma α-manosidase de Paracoccidioides brasiliensis e determinação de seu papel na relação fungo-hospedeiro - Corrêa, Priscila Cristina (2021)
Os fungos termodimórficos do gênero Paracoccidioides causam a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica endêmica em países da América do Sul, incluindo o Brasil, que detém cerca de 85% dos casos de PCM. À temperatura ambiente, os fungos se apresentam na forma filamentosa (hifa), que quando inalada por seres humanos na forma de propágulos ambientais do fungo, a temperatura corpórea (37ºC) induz a transformação do fungo para levedura, a forma de resistência e patogênica do fungo, levando a uma inflamação crônica, principalmente nos pulmões. Em estudos preliminares, identificou-se no sobrenadante de culturas do isolado Pb18 de P. brasiliensis a presença de uma α-manosidase vacuolar. Ao se avaliar a expressão gênica desta α-manosidase observou-se uma correlação positiva entre a expressão gênica da proteína e a virulência de P. brasiliensis, uma vez que se mostrou-se significativamente maior nos transcritos obtidos em leveduras do que em micélio em isolados com diferentes graus de virulência, mantendo-se elevada em leveduras da linhagem virulenta cultivada em diferentes meios de cultura. No presente trabalho foi realizado o isolamento da proteína do sobrenadante de cultura de leveduras de Pb18 utilizando cromatografia de troca aniônica, em pH 8,0, em que a enzima manteve suas propriedades catalíticas após eluição com aumento da força iônica em um gradiente de NaCl nas concentrações entre 0,2 e 0,5M. Para aprimorar o estudo, foi obtida uma α-manosidase recombinante em bactérias Escherichia coli da linhagem Rosetta transformada com o vetor pET15b clonado com o gene da α-manosidase vacuolar de P. brasiliensis, sendo padronizadas as condições de expressão. Determinou-se que a melhor condição para induzir a proteína recombinante nessas bactérias transformadas era em culturas com densidade óptica a 600nm de 0,7, à temperatura ambiente, por 30 horas, sob agitação constante. A proteína contendo uma etiqueta de seis histidina na região N-terminal foi purificada utilizando-se cromatografias de afinidade em coluna de níquel imobilizado e de troca iônica em coluna HiTrap Q XL pH 9,0, tendo os maiores valores de atividade enzimática relativa na eluição entre 0,2 e 0,5M de NaCl. A análise da proteína recombinante por cromatografia em coluna Superdex 200 revelou que a atividade enzimática é recuperada em uma massa molecular aparente de 128kDa. Essa atividade da enzima recombinante foi analisada após isolamento em cromatografias de afinidade em coluna de níquel imobilizado e de troca iônica, mostrando condições ótimas para hidrólise do substrato em pH 6,0 e temperatura de 45ºC, evidenciado uma alta estabilidade da enzima após incubação em temperatura ótima, e manutenção da catálise na ausência de cátions divalentes. Os ensaios de fagocitose realizados in vitro mostraram que macrófagos pré-tratados com a molécula recombinante apresentaram maiores taxas fagocíticas de P. brasiliensis em relação aos controles não tratados ou estimulados com albumina bovina, sugerindo que essa enzima pode ter um papel significativo na interação do fungo com o hospedeiro.