Identificação de proteínas que interagem com a porção citoplasmática C-terminal do receptor para Angiotensina II (AT1aR) em células de tecido renal - Bezerra, Camila Nogueira Alves (2010)
O receptor para Angiotensina II tipo 1 (AT1R) é expresso tanto em membrana apical quanto basolateral dos túbulos proximais renais. Embora haja evidências de diferenças funcionais entre receptores apicais e basolaterais, como, por exemplo, a dependência do processo de internalização de receptores apicais, mas não de basolaterais, para a efetivação dos efeitos fisiológicos da Angiotensina II, os mecanismos envolvidos na determinação dessas diferenças não são conhecidos. Alguns trabalhos já evidenciaram a importância da porção c-terminal do receptor AT1 na sua internalização. Desta forma, com o intuito de identificar proteínas de membrana que possam interagir com tal região, foi feita a clonagem do fragmento de DNA correspondente a esta no vetor pGEX-6P-2. O produto da transcrição e tradução do gene foi uma proteína de fusão (GST-AT1aR) que possui em torno de 35kDa, a qual foi imobilizada em resina de glutationa sefarose e incubada com proteínas de membranas totais de córtex renal de ratos (GST pull-down assay). As amostras foram submetidas à Eletroforese Bidimensional, onde identificamos seis spots correspondentes a proteínas que interagem especificamente com a proteína de fusão, mas não com GST. Estes spots foram recortados e analisados por espectrometria de massa. Cinco diferentes proteínas foram identificadas como provavelmente associadas ao receptor AT1aR: ATP sintase subunidade beta, ATP sintase subunidade alfa mitocondrial, GRP78 (heat shock protein de 78kDa regulada por glicose), HSC70 (heat shock protein de 71kDa) e dipeptidil peptidase 4 (DPPIV). Experimentos subsequentes de GST pull-down e western blotting para as proteínas encontradas, confirmaram interação da cauda C-terminal do receptor com as proteínas ATP sintase subunidade beta, HSC70 (heat shock protein de 71kDa) e GRP78 (heat shock protein de 78kDa regulada por glicose). No entanto, nos estudos de co-imunoprecipitação foi possível confirmar apenas a interação com HSC70, um membro da família HPS70, uma heat shock protein. HSP são também chamadas de chaperonas por estarem envolvidas no dobramento correto de proteínas recém sintetizadas, no redobramento de proteína desnaturadas ou dobradas incorretamente e na degradação de proteínas com danos irreparáveis. No entanto, trabalhos recentes descrevem novos papéis para esta proteína, como a participação em processos de tráfego protéico entre compartimentos intracelulares, reciclagem de proteínas para a membrana plasmática e endocitose mediada por clatrina. Novos estudos serão necessários para se determinar a função fisiológica da interação de HSC70 com a cauda citoplasmática do receptor AT1 e ainda, se essa associação estaria envolvida nas diferenças funcionais observadas quando esse receptor é expresso em membrana apical ou basolateral