Novos aspectos do efeito antibacteriano de galectinas ligantes de lipopolissacarídeo - Amstalden, Martin Krähenbühl (2021)
A resistência bacteriana a antibióticos é um grave problema global de saúde pública que impõe urgência na busca por novos agentes antibacterianos. As galectinas são proteínas que reconhecem glicanas β-galactosiladas, por meio de seus domínios de reconhecimento de carboidratos (CRD), e participam de diversos processos celulares e moleculares relacionados a doenças infecciosas. Nesse sentido, galectina-4 (Gal-4) e galectina-3 (Gal-3) interagem com a porção O-PS (unidade repetida do antígeno O) do lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli O86. Apenas Gal-4, via seu domínio C-terminal (Gal-4C), promove a perda da integridade de membrana e a morte bacteriana de forma semelhante aos peptídeos antimicrobianos (AMPs). Sabe-se que um dos fatores associados a ação bactericida dos AMPs depende de suas interações com os grupos fosfatos carregados negativamente da porção lipídeo-A do LPS. Este trabalho teve como objetivos a i) caracterização do efeito bactericida de Gal-4 em E. coli O86 frente a mecanismos antimicrobianos conhecidos e de resistência a AMPs; e ii) a análise do impacto de Gal-4 ou Gal-3 na ação bactericida de antibióticos conhecidos. A viabilidade de E. coli O86 selvagem (O-PS+) e mutante ΔwaaL (O-PS-) tratadas com galectinas em associação ou não com antibióticos [ampicilina (Amp), polimixina-B (PmB) e ciprofloxaxino (Cipro)] foi determinada através de contagem de unidades formadoras de colônias. A influência da reação de Fenton intracelular no efeito bactericida de Gal-4 foi avaliada utilizando-se 2,2\'-bipiridina (agente quelante) e tioureia (agente antioxidante). O impacto das galectinas nas membranas destas bactérias foi avaliado por microscopia de força atômica. A análise in silico do potencial mecanismo molecular da ação bactericida de Gal-4C foi feita a partir de um modelo de membrana de E. coli O86 e por simulações de dinâmica molecular. As condições testadas de resistência aos AMPs foram baseadas no uso dos cátions Mg2+ (inibe a interação antibiótico/lipídeo-A ou induz a incorporação do grupo fosfato no lipídeo-A) e Fe3+ (induz a substituição dos grupos fosfato do LPS). Além disso, foram utilizadas E. coli O86 O-PS+ e O-PS- transformadas com um plasmídeo contendo o gene mcr-1 de resistência a PmB (pMQ124-mcr-1). Como esperado, Gal-4 provocou uma rápida e drástica redução (~ 95%) de viabilidade em E. coli O86 de modo dependente de seu CRD. Este estudo demonstrou que i) a ação de Gal-4 foi dependente da concentração inicial bacteriana; ii) E. coli O86 tratada com Gal-4 apresentou um crescimento microbiano residual, extrusões vesiculares indicativas da perda da integridade de membrana, e formação de macro agregados bacterianos contendo unidades viáveis; e iii) a ação de Gal-4 foi parcialmente suprimida pelos mecanismos de inibição da reação de Fenton intracelular. Gal-3 reduziu a viabilidade de E. coli O86 somente em altas concentrações e de modo dependente da interação com O-PS. Os achados in sílico sugeriram que a interação de Gal-4C com a membrana de E. coli O86 obedeceu a sequência de eventos termodinamicamente favoráveis composta pelas seguintes etapas: i) interação de Gal4C, que possui propriedades anfifílicas semelhantemente aos AMPs, com a região O-PS do LPS; ii) inserção de uma região hidrofóbica de Gal-4C na porção apolar da membrana externa x bacteriana. Os efeitos antibacterianos de Gal-4 e Gal-3 foram independentes da presença de mecanismos de resistência a AMPs em E. coli O86. Além disso, Gal-4 e Gal-3 agiram sinergicamente com PmB na bactéria selvagem, mediados por interações com seus CDRs, mesmo na presença de mecanismos de resistência a AMPs; quando adicionadas concomitantemente em E. coli O86, Gal-4 e Gal-3 agiram sinergicamente para reduzir a viabilidade bacteriana de forma dependente do reconhecimento de carboidrato. No entanto, a ausência da região N-terminal de Gal-3 aboliu o seu efeito de redução de viabilidade bacteriana, assim como seus efeitos sinérgicos com PmB e Gal-4. Somente uma concentração bactericida de Gal-4 apresentou efeito sinérgico com Cipro. Este trabalho foi pioneiro em demonstrar que as ações antibacterianas de Gal-4 e Gal-3 em E. coli O86 independem da presença de mecanismos de resistência a AMPs, e que estas galectinas agem sinergicamente com outros agentes antimicrobianos. Finalmente, este trabalho poderá cooperar para o melhor entendimento da participação das galectinas na imunidade contra bactérias e gerar novas perspectivas biotecnológicas aplicáveis à terapêutica antibacteriana, baseadas no reconhecimento da porção O-PS do LPS.