Estudo das Proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de Nicotiana tabacum L. e seu Papel no Desenvolvimento Floral - Bertolino, Lígia Tereza (2014)
A modulação da forma e tamanho em órgãos vegetais depende do controle temporal e espacial de divisão e expansão celular. Entretanto, pouco se sabe a respeito dos mecanismos moleculares que regulam este processo durante o desenvolvimento floral. O estudo da via de sinalização de SCI1 (Stigma/style Cell Cycle Inhibitor 1) pode contribuir para o entendimento do processo de crescimento das flores. Este gene produz uma proteína, localizada no nucléolo, que está relacionada à inibição da proliferação celular no estigma e no estilete de Nicotiana tabacum, modulando o tamanho destes órgãos florais. Experimentos feitos para a identificação de parceiros de interação de SCI1 identificaram as proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum como candidatas à interação. A família 14-3-3 é composta de proteínas altamente conservadas, que formam dímeros em sua conformação nativa e são responsáveis pela modulação da atividade das mais variadas proteínas em resposta a sinais intracelulares. Por isso, estas proteínas estão associadas à regulação de uma série de processos, incluindo o metabolismo, transcrição, ciclo celular, entre outros. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo estudar as proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum e o seu papel durante o desenvolvimento floral. Os resultados aqui obtidos revelaram que a 14-3-3A possui localização citoplasmática e nuclear, enquanto a 14-3-3D se distribui apenas no citoplasma. Também foi evidenciado que estas proteínas são capazes de formar homodímeros e heterodímeros entre si. Os homodímeros de 14-3-3A estão distribuídos no citoplasma e no núcleo, enquanto os homodímeros de 14-3-3D e heterodímeros se encontram apenas no citoplasma. Adicionalmente, a interação in vivo entre a 14-3-3A e SCI1 foi confirmada por BiFC, apresentando localização nuclear, fora do nucléolo. Análises in silico da sequência de aminoácidos de SCI1 identificaram duas regiões putativas de reconhecimento por proteínas 14-3-3s. Estas regiões estão sendo analisadas funcionalmente por meio de ensaios de BiFC com sequências mutadas de SCI1. A análise deste conjunto de resultados, juntamente com outros resultados obtidos em nosso laboratório, sugere que apenas homodímeros de 14-3-3D e heterodímeros formados entre 14-3-3A e 14-3-3D sejam capazes de interagir com SCI1. Adicionalmente, a localização nuclear dessa interação difere daquelas observadas para SCI1 e para as 14-3-3s individualmente, sugerindo que as 14-3-3s migrem para o núcleo para interagir com SCI1. Nossa hipótese é de que as proteínas 14-3-3s possam modular a localização subnuclear de SCI1. Com o objetivo de levantar dados a respeito das possíveis funções desempenhadas pelas proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum, foram identificados os grupos de possíveis ortólogos dessas proteínas em A. thaliana, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum e N. benthamiana. Esta análise mostrou que os ortólogos às 14-3-3A e D em Arabidopsis estão associados ao ciclo celular, o que sugere que as proteínas de tabaco possam ter conservado essa função. Além disso, também foram produzidas plantas transgênicas silenciadas para cada uma dessas 14-3-3s de maneira independente. A análise dos fenótipos das plantas transgênicas não levou à elaboração de uma hipótese definitiva sobre a função dessas 14-3-3s no desenvolvimento floral. No entanto, algumas plantas transgênicas apresentaram estruturas menores, especialmente as pétalas, sugerindo que estas proteínas podem estar envolvidas no controle do tamanho de órgãos vegetais.