Caracterização e investigação funcional de splicings alternativos do gene P4HB da dissulfeto isomerase proteica (PDI) - Kajihara, Daniela (2019)
O splicing alternativo (AS) é um processo que produz diferentes mRNAs de um transcrito primário, resultando na produção de isoformas de proteínas que podem exibir propriedades funcionais distintas e localização subcelular. Mais de 90% dos genes humanos sofrem AS. O gene P4HB codifica a proteína PDIA1 (proteína dissulfeto isomerase-A1), uma chaperona redox composta basicamente por quatro domínios tiorredoxina. A PDIA1 exerce função esssencial na proteostase mediante funções como chaperona e isomerase ou oxido-redutase de grupos tiol em cisteínas, catalisando a inserção adequada de pontes dissulfeto em proteínas nascentes no retículo endoplasmático. A atividade de isomerase de PDI requer a presença de todos os seus domínios redox catalíticos (a e a\') e os domínios não redox (b e b\'), enquanto as isoformas poderiam possuir estruturas distintas e atuaream como oxidoredutases, ou apenas chaperonas. Ainda, a PDIA1, amplamente expressa, pode ter efeitos adicionais na homeostase celular. Nosso grupo tem caracterizado uma série de funções da PDIA1 na sinalização redox, homeostase e respostas biomecânicas, em alguns casos envolvendo locais de proteína subcelular adicionais, como na superfície celular ou no meio extracelular. No entanto, há muito pouca informação sobre a regulação, expressão e localização de transcritos derivados de processamento alternativo da PDI e a localização de diferentes produtos protéicos. Avanços recentes nos dados de NGS (Next Generation Sequencing) e proteômicos forneceram informações mais acuradas de variantes alternativamente processadas. A disponibilidade de dados de RNA-seq de diferentes fontes tornou possível a investigação de variantes de splicing usando uma quantidade razoável de dados, contemplando diferentes tipos e tecidos celulares. Usando três diferentes bases de dados RNA-seq, investigamos o perfil de isoformas alternativamente processadas da PDIA1. A análise das bases FANTOM5 (Anotação Funcional de Genoma de Mamíferos, que reuniu informações biológicas de 70 amostras de RNA-seq), Projeto ENCODE/Caltech e CSHL RNA-seq e Projeto GTEx (Genotype-Tissue Expression, um enorme banco de dados com mais de 10.000 amostras), identificamos a expressão das variantes de splicing do gene P4HB em diferentes tipos de células e linhagens celulares cancerígenas. A expressão das variantes de splicing do gene P4HB compreende 10 variantes que possuem a sequência de codificação de proteína. Desenvolvemos abordagens específicas para quantificar as variantes desse gene. Para validar a junção específica para cada variante de splicing, nós desenhamos oligonucleotídeos para amplificar a junção, clonamos e sequenciamos a região específica de cada uma das três variantes. Os dados indicam que a expressão das isoformas do gene P4HB é altamente variável entre os diferentes tecidos e células e mesmo entre diferentes tipos da mesma célula, por exemplo, células musculares lisas de aorta vs. coronária. A análise da sequência das isoformas mostra que apenas uma, a P4HB-021, tem os quatro domínios tiorredoxina, apenas duas conservam a sequência de retenção no retículo endoplasmático e várias tem truncamentos dos distintos domínios, sugerindo que os produtos proteicos derivados não devam apresentar atividadade isomerase canônica. Analisamos a expressão gênica de três variantes de splicing em células HEK293 e células musculares lisas primárias submetidas à carenciamento de soro, tratamento com tunicamicina e cloreto de cobalto para mimetizar a hipóxia. O gene da P4HB e da isoforma P4HB-021 foram responsivos ao carenciamento de soro em células musculares lisas humanas. A importância da isoforma P4HB-021 neste tipo celular foi também confirmada por análise de outros bancos de dados e experimentos da literatura. Interessante, a estrutura prevista para P4HB-021 indica uma proteína com maior mobilidade que a proteína canônica. Estes dados indicam uma base para o entendimento da regulação gênica do gene da PDIA1 e podem contribuir para o entendimento das diversas funções previamente descritas por nosso grupo para a PDIA1 neste tipo celular