Desenvolvimento do processo de produção em biorreator do bioinseticida Spodoptera frugiperda MNPV em células de inseto Sf-9. - Klafke, Karina (2020)
O Brasil é um dos maiores produtores e exportadores de milho do mundo, portanto danos ao cultivo podem trazer um prejuízo econômico considerável. A Spodoptera frugiperda é a praga mais comum de milho nas Américas e os baculovírus são patógenos naturais desta, podendo atuar como bioinseticidas. Atualmente, são empregadas estratégias in vivo para produção em escala comercial através da multiplicação do vírus no próprio inseto hospedeiro em instalações de biofábricas, no entanto, a alternativa de produção in vitro em cultura de células de insetos em larga escala por meio de biorreatores pode trazer vantagens econômicas. Neste estudo buscou-se desenvolver o processo de produção in vivo de SfMNPV através do estudo de diferentes multiplicidades de infecção (MOI) e suplementações nutricionais, análises morfológica e molecular da infecção e testes do efeito da diminuição de cisalhamento no crescimento e produção de vírus. O projeto foi desenvolvido em uma parceria da Escola Politécnica da Universidade de São Paulo (GEnBio-USP) com a EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen) e com o United States Department of Agriculture (Laboratório NRS-FS/USDA). Os experimentos foram feitos com células Sf-9 em meio de cultivo Sf-900 III e ExCell 420 em frascos e em biorreatores STR aspergido, STR bubble free e Wave. De início, testou-se uma série de suplementações para o meio de cultivo ExCell 420 e definiu-se que a melhor condição dentre as avaliadas foi a combinação da adição de 2 g/L de glicose e 200 mg/L de ácido cisteico, que elevou a densidade celular em 37,5%, resultando em uma concentração celular máxima de 8,8x106 cel/mL em frasco shaker. Já para o meio de cultivo Sf-900 III, foi definida a adição de 1,0 g/L de glutamina nos ensaios em biorreator. Os cultivos em biorreator STR aspergido tiveram média de velocidade específica de crescimento máxima (µmáx) de 0,60 dia-1. Cultivos em STR bubble free apresentaram impacto significativo no valor da concentração celular máxima (Xvmáx), atingindo valores de 10x106 cel/mL, representando aumento de 42,8% comparada à abordagem STR aspergido, acompanhada de queda no µmáx para 0,30 dia-1. Da mesma forma, cultivos em reator Wave com meio ExCell 420 apresentaram, em média, aumento de 42,5% em Xvmáx comparada com o equivalente em STR e µmáx em torno de 0,45 dia-1. Estes dados corroboram o efeito do cisalhamento como importante fonte de estresse celular. A análise metabólica dos ensaios com meio de cultivo Sf-900 III foram ao encontro de dados da literatura, confirmando a eficiência no metabolismo via ciclo TCA para células Sf-9, entretanto, devido a valores levemente aumentados de concentração de amônio, supõe-se que possa estar ocorrendo fenômeno reportado como efeito de densidade, em que há perda de eficiência metabólica devido a inibição por alta concentração celular. Ademais, observou-se também aumento de consumo de glicose pós infecção. Por fim, a otimização da etapa de crescimento celular levou à melhora significativa na etapa de produção viral. Em ensaios de biorreator foi confirmado MOI de 1,0 como parâmetro otimizado sem alterações genéticas virais. Cultivo em biorreator STR aspergido com meio ExCell 420 obteve produção de 6x1010 pol/L, em comparação com seu equivalente em Wave de 43x1010 pol/L, que teve a melhor reprodutibilidade do estudo. Contudo, a abordagem de STR aspergido em meio de cultura Sf-900 III combinado ao MOI de 1,0 e suplementação com glutamina foi a que apresentou melhor desempenho de produção viral com produtividade específica acima de 300 pol/cel e volumétrica de 9x1011 pol/L.