Análise in vivo e in vitro da forma truncada ΔNp73 na leucemia promielocítica aguda - Araujo, Antonio Roberto Lucena de (2012)
O ΔNp73 é uma forma truncada do gene TP73 e atua como um potente inibidor da atividade transcripcional das proteínas TP53 e TAp73, desempenhando, desta forma, um importante papel na proliferação e morte celular. Na verdade, o que determina a atividade oncogênica do gene TP73 é um balanço entre suas isoformas transcricionalmente ativa (TAp73) e inativa (ΔNp73), e essa relação correlaciona-se com o prognóstico clínico e falha no tratamento em diversas neoplasias humanas, incluindo leucemia mielóide aguda (LMA). Nosso grupo relatou previamente que na LMA, uma maior relação de expressão ΔNp73/TAp73 está associada com leucemias de pior prognóstico e resistência à apoptose induzida citarabina. Na leucemia promielocítica aguda (LPA), ambas as formas são expressas, mas seu significado clínico ainda é desconhecido. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar se relação da expressão ΔNp73/TAp73 está associada com o prognóstico de pacientes com LPA e investigar os mecanismos pelos quais o ΔNp73 pode conferir à células PML-RARa+ vantagem proliferativa. Usando sondas isoforma-específicas para as variantes TAp73 e ΔNp73, a análise da expressão gênica foi realizada em 166 amostras de pacientes com LPA por reação em cadeia da polimerase quantitativa. Os pacientes foram divididos em tercis (mediana = 1.12; percentil 33º/66º = 0.68/2.54) e suas características clínicas e laboratoriais foram comparados. Foi observado que os pacientes alocados no 3º tercil (pacientes que apresentaram uma alta relação de ΔN/TA) apresentaram uma maior contagem de leucócitos no sangue periférico ao diagnóstico (p < 0,001), bem como uma maior frequência de mutação do gene FLT3 (p = 0,001). Além disso, a maioria dos casos de pacientes com alto risco de recidiva apresentaram altos níveis de expressão ΔN/TA (risco relativo [RR]: 2,36, IC95%: 1,7-3,28). Os resultados de desfechos clínicos foram obtidos em 131 pacientes inseridos nos protocolos de tratamento APL99 (n = 41) e IC-APL (n = 90). O tempo médio de seguimento desses pacientes foi de 29,1 meses, variando de 1 a 85,5 meses, com estimativa de sobrevida em cinco anos de 77,8% ± 3,6%. A sobrevida global (SG) média de todos os pacientes foi de 66,8 meses [IC95%: 60,8-72,8]. Análise univariada identificou risco de recidiva (p = 0,016), alta relação ΔN/TA (p = 0,014) e presença de mutação do gene FLT3 (p = 0,011) como fatores preditivos de SG. Entretanto, apenas as duas primeiras variáveis foram independentemente associadas a SG (ΔN/TA, risco proporcional [RP]: 1,20, IC95%, 1,09-1,45, p = 0,042; risco de recidiva, RP: 1,86, IC95%, 0,99-3,52, p = 0,05). Até abril de 2011, um total de oito recidivas (6,1%) foram registradas. A taxa de sobrevida livre de doença (SLD) em cinco anos foi de 88,3% ± 4,2% e a SLD média foi de 76,1 meses [71,2-80,9]. SLD foi significativamente menor nos pacientes do 3º tercil comparados com pacientes do 2º e 1º tercis (72,1 ± 11,2% vs 97,1 ± 2,8% vs 100%, respectivamente, p < 0,001). Para testar a significância funcional da associação entre a oncoproteína PML-RARa com a hiperexpressão do gene ΔNp73, células da medula óssea de camundongos transgênicos hCG-PML-RARa foram transfectadas com o vetor retroviral MSCV carregando o cDNA ΔNp73 (PML-pMIG-ΔN). Expressão do ΔNp73 em células PML-RARa+ aumentou da taxa de proliferação celular em 2,5 vezes em comparação com PML-RARa+ transfectadas com o vetor vazio (p = 0,03). Este aumento foi resultado de acúmulo de células na fase G2/M (5,8 ± 0,08% para PML-pMIG vs 9,8 ± 0,3% para PML-pMIG-ΔN, p < 0,001), bem como na fase S do ciclo celular (27,7 ± 0,9% para PML-pMIG vs 36,8 ± 0,8% para PML-pMIG-ΔN, p = 0,001). Além disso, a transfecção do ΔNp73 resultou em resistência à apoptose induzida por citarabina. Após 24h de cultura com 100µg/ml de citarabina (dose efetiva-50%), o efeito fracionário para a droga (% anexina-V+ (células tratadas - não tratadas)/100 - % anexina-V+ em células não tratadas) foi de 32,1% para PML-pMIG-ΔN e 54,8% para PML-pMIG (p < 0,001). Em conclusão, o aumento de expressão relativa do gene ΔNp73 está associado com uma menor SG e SLD em pacientes com LPA, o que parece ser reflexo de um aumento da proliferação celular e resistência à apoptose induzida por este gene.