Estudo e caracterização parcial de amilases de banana (Musa acuminata cv Nanicão) - Bassinello, Priscila Zaczuk (2002)
O desaparecimento do amido é uma das alterações mais marcantes observadas durante o amadurecimento da banana. A transformação amido/sacarose envolve diversas enzimas e mais de uma via metabólica. Com o intuito de estudar as propriedades das amilases e seu envolvimento nesse metabolismo, procurou-se otimizar a metodologia de extração das proteínas e de atividade enzimática, purificação e caracterização parciais em bananas durante o amadurecimento. A determinação de atividade hidrolítica total foi realizada com base nos métodos sacarogênico e iodométrico. A atividade α-amilásica ou endoamilolítica foi medida pelos métodos cromogênicos que utilizam como substratos amilose-azure ou BPNPG7. A atividade β-amilásica foi determinada com o substrato PNPGS. As atividades hidrolítica total, α- e β-amilásica aumentam durante o amadurecimento de banana, sendo que o aumento da atividade de α-amilase antecipa o pico climatérico e as demais atividades, especialmente β-amilásica, apresentam aumento mais pronunciado após o pico climatérico, o que sugere uma ação anterior de α-amilases sobre os grânulos de amido e a atuação das demais enzimas hidrolíticas principalmente sobre os produtos liberados pelas α-amilases. A dessalinização dos extratos através de exclusão molecular propiciou melhores resultados para a atividade enzimática, removendo possíveis inibidores dessa atividade. O uso de EDTA no meio de atividade parece reduzir a atividade de amilases sobre amilose-azure, mas sua especificidade nessa inativação é duvidosa, bem como a do cloreto de mercúrio ou do tratamento térmico como meios de inibir a atividade de β-amilases. Os resultados levam à recomendação da utilização dos métodos de determinação da atividade hidrolítica total para o rastreamento geral das enzimas e métodos mais específicos para a diferenciação entre as atividades de α- e β-amilases. Para a purificação de amilases solúveis de banana foram testadas várias técnicas, incluindo precipitação de proteínas por saturação com sulfato de amônia, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, isoeletrofocalização e eletroforese nativa e dissociante. Parece que, em banana, as amilases estão presentes em várias isoformas com diferenças sutis de peso molecular, ponto isoelétrico e força iônica, conforme perfis obtidos por cromatografia de troca iônica, isoeletrofocalização e SDS-PAGE. As diferentes amilases apresentaram atividade sobre amido em gel de eletroforese e sobre BPNPG7 e PNPG5 in vitro. As cromatografias de troca catiônica e de afinidade com eluição em duas etapas foram importantes ferramentas de separação entre fosforilases contaminantes e algumas amilases do extrato. As α-amilases solúveis de banana com atividade sobre BPNPG7 apresentaram peso molecular estimado em SDS-PAGE na faixa entre 47,5 e 52 KDa, valores obtidos após fracionamento do gel, e pΙ na faixa de 4,6 a 6,0, com pico de atividade sobre BPNPG7 para a proteína com pΙ de 5,8. As α-amilases parecem também estar associadas aos grânulos de amido isolados do fruto em três isoformas ativas em gel de eletroforese com amido e sobre BPNPG7 in vitro. As três isoformas recortadas de gel e aplicadas em SDS-PAGE geraram um peso molecular ao redor de 40 KDa. Conclui-se que o extrato de banana é bastante complexo, contendo várias enzimas com atividade hidrolítica sobre diferentes substratos. A separação entre as enzimas e purificação de amilases exige, portanto, a aplicação de diferentes técnicas, as quais mesmo quando combinadas, não respondem pela total homogeneidade da proteína. Os resultados sugerem a existência de uma família multigênica para amilases de banana conforme indicado em trabalho anterior via técnicas de biologia molecular.