Epigenética da reprogramação em células germinativas embrionárias caninas - Souza, Aline Fernanda de (2017)
As células germinativas primordiais (CGPs) são as precursoras dos gametas, capazes de gerar um novo indivíduo os quais transmitirão os materiais genéticos para as futuras gerações. Normalmente, a linha germinal de mamífero é determinada por fatores genéticos e epigenéticos que possuem funções essenciais para guiar na direção e desenvolvimento das CGPs, bem como das células germinativas embrionárias (CGEs). A reprogramação epigenética é fundamental para a regulação do genoma durante o desenvolvimento das células germinativas responsáveis por originar a linhagem gametogênica nos mamíferos. A metilação e desmetilação em CGPs são um evento único, essencial para apagar a memória epigenética e também prevenir transmissões de epimutações para a próxima geração. Assim, o completo entendimento das vias e mecanismos para a migração inicial e diferenciação destas células em CGEs podem ser importantes para identificar e corrigir falhas possíveis nesses processos, o que será importante, no futuro, para o desenvolvimento e desempenho reprodutivo. A maioria dos estudos com CGPs e CGEs é realizado em camundongos, porém nem sempre esta espécie torna-se o melhor modelo de estudo quando se quer transpor esses conhecimentos a humanos. O cão doméstico (Canis lúpus familiaris) apresenta-se como um modelo ideal para o estudo do desenvolvimento em mamíferos, pois possui inúmeras similaridades com a bioquímica, fisiologia e genética. Deste modo, torna-se interessante expandir os estudos sobre as CGPs e CGEs na espécie canina, a fim de mostrar a importância de diferentes modelos que se assemelham a seres humanos. Portanto, objetiva-se, nesta proposta, identificar qual é a dinâmica de marcadores pluripotentes, germinativos e epigenéticos que são importantes para o desenvolvimento das CGPs e CGEs caninas. Para tal procedimento, essa pesquisa foi dividida em duas fases: a primeira, consiste no processo in vivo, desde o desenvolvimento inicial do embrião até a completa formação da crista gônadal. Análises de RTq-PCR e imunofluorescência para marcadores pluripotentes POU5F1 (OCT4) e NANOG, germinativos DDX4 (VASA), DAZL e DPPA3 (STELLA) e epigenéticos 5mC, 5hmC, H3K27me3 e H3K9me2 foram realizados para criar um perfil de genes que são importantes para o desenvolvimento das CGPs caninas. Prosseguiu-se para a segunda fase in vitro, que incide na derivação e caracterização das CGEs caninas. Ensaios de Fosfatase Alcalina, imunofluorescência para os marcadores: pluripotente POU5F1 (OCT4), germinativos DDX4 (VASA), DAZL e DPPA3 (STELLA), mesodérmico THY-1 (CD90) e epigenéticos 5mC, 5hmC, H3K27me3 e H3K9me2, RT-qPCR para os genes NANOG e DDX4 e formação de teratoma foram efetivados para comprovar a linhagem de células CGEs. Como resultado in vivo, percebe-se que diferentes padrões de marcações e genes foram expressos nas CGPs, comprovando que a espécie canina se assemelha mais com os humanos do que com os camundongos. Os resultados in vitro mostraram que foi possível derivar as células CGEs e que estas conseguem reter sua pluripotencialidade e que diminuem a expressão dos genes germinativos. Porém, essas células tendem a se diferenciar em outros tecidos somáticos, mesmo com a adição de suplementos, fato também notado em CGEs humanas.