Detecção de mixosporídeos por PCR em Tempo Real e por PCR Convencional em amostras de água de pisciculturas - Ribeiro, Amanda Murarolli (2020)
Mixosporídeos são cnidários cosmopolitas e endoparasitas obrigatórios, com cerca de 2.600 espécies descritas. Possuem um complexo ciclo biológico, caracterizado pela transmissão via esporos multicelulares. Podem ser encontrados em vários tecidos e órgãos de vertebrados, principalmente peixes, mas também em anfíbios, répteis, aves e mamíferos. Esses cnidários também são encontrados em invertebrados aquáticos (oligoquetas), estes atuam como hospedeiro definitivo e os vertebrados atuam como hospedeiros intermediário. Uma variada gama de espécies de mixosporídeos são importantes patógenos de peixes, e apresentam grande impacto econômico na aquicultura e na pesca extrativista, no mundo inteiro. No Brasil são descritas aproximadamente 140 espécies de mixosporídeos e algumas dessas em peixes nativos e de sistemas de criação têm se mostrado patogênicas ou com grande potencial para causar danos em seus hospedeiros, ocasionando impactos e prejuízos econômicos tanto na pesca quanto na aquicultura. Os métodos tradicionais de detecção desses parasitas em peixes e oligoquetas necessitam da captura dos hospedeiros, para a obtenção de cistos ou esporos e normalmente estes métodos demandam muito trabalho envolvendo uma série de etapas, e a necessidade de vários equipamentos. Ainda quando não há a presença visível de infecções ou altas taxas de mortalidades de peixes, a detecção dos parasitas pode ser dificultada. Este estudo teve como objetivo otimizar métodos para detectar a presença de DNA de mixosporídeos através da análise do SSrDNA em amostras ambientais através das técnicas de PCR Convencional (cPCR) e PCR em Tempo Real (qPCR), oferecendo métodos simples de detecção precoce, e que podem avaliar e quantificar a presença de mixosporídeos na água de pisciculturas. Foram coletadas 48 amostras de água de duas pisciculturas do interior do estado de São Paulo. As amostras contendo cada um 1 litro de água foram armazenadas em gelo e conduzidas para o laboratório. Posteriormente, as amostras foram processadas seguindo as etapas: filtração à vácuo em membrana de nitrato de celulose; extração de DNA de esporos reditos na membrana; Reação de cPCR e qPCR com primers descritos na literatura, e primers construídos para esse estudo. A metodologia utilizada para a filtração e extração de DNA mostraram-se eficientes para a obtenção de DNA de esporos de mixosporídeos presentes na água e as concentrações de DNA variaram entre 1,6 ng a 53,2 ng. A cPCR foi capaz de detectar até 0,1 x 10-3 ng de DNA e identificar 24 amostras positivas (50%). A qPCR detectou concentrações de até 0,1 x 10-4 ng de DNA de mixosporideos e 40 amostras coletadas (83%) foram positivas. Os resultados desse trabalho, mostraram que a qPCR é mais sensível que a cPCR sendo capaz de detectar a presença do SSrDNA de mixosporídeos em um número maior de amostras.