Modificação de células-tronco espermatogoniais para produção de bovinos transgênicos - Barros, Flavia Regina Oliveira de (2012)
A espermatogênese em mamíferos é um processo sustentado pela auto-renovação e diferenciação de células-tronco espermatogoniais (SSCs). O estudo destas células oferece um excelente modelo para o melhor entendimento da biologia das células-tronco adultas e dos mecanismos que controlam as funções das SSCs. Além do potencial biomédico para estudos sobre infertilidade em diferentes espécies, as SSC possuem uma aplicação promissora na biotecnologia para a produção de animais transgênicos. Assim, o objetivo deste trabalho foi responder à pergunta: "SSCs bovinas LacZ+ podem integrar-se aos túbulos seminíferos de bezerros pré-púberes da raça Nelore após transplante autólogo?" Para isso, bezerros Nelore de 5 meses de idade (n=16) foram submetidos a uma orquiectomia unilateral para o isolamento de células espermatogoniais por digestão enzimática. Após o plaqueamento diferencial, as células foram transduzidas com um vetor lentiviral contendo a sequencia do gene marcador LacZ. Para isso, os animais foram aleatoriamente alocados em um dos quatro grupos experimentais: LacZ+/PKH26+, LacZ+/PKH26-, LacZ-/PKH26+, LacZ-/PKH26-. Após 60 h do início do cultivo in vitro, as células espermatogoniais foram transplantadas autologamente para o mediastino do testículo remanescente por injeção guiada por ultrassonografia. O testículo transplantado foi removido cirurgicamente após 45 dias e amostras de tecido foram submetidas a reação com x-gal para verificação da integração de células espermatogoniais transgênicas aos túbulos seminíferos. Células espermatogoniais foram isoladas e cultivadas in vitro com sucesso. Contudo, não foi possível obter uma população pura de SSCs por plaqueamento diferencial. Embora tenha sido eleito o transplante de células espermatogoniais e não de SSCs somente, sabe-se que também foram transplantadas SSCs, pois a caracterização das células isoladas demonstrou a expressão dos marcadores de SSCs ITGA6, GFRa-1, PGP 9.5 e afinidade pela lectina DBA. Crioseções de amostras de tecido testicular coradas com x-gal permitiram a observação de células transgênicas em 8 de 8 animais que receberam células LacZ+. Contudo, todas as células transgênicas observadas estavam situadas no interstício. Concluindo, não foi possível observar a integração das células transgênicas transplantadas aos túbulos seminíferos do testículo receptor após 45 dias do transplante autólogo utilizando a técnica de injeção intratesticular de células espermatogoniais LacZ+ no mediastino de bezerros pré-púberes da raça Nelore.