Caracterização de mecanismos de resistência à terbinafina em diferentes espécies de Leishmania - Dias, Fabrício César (2008)
O fenômeno de amplificação gênica é um mecanismo de auto-preservação celular observado com freqüência no protozoário parasita Leishmania quando submetido a estímulos negativos como, por exemplo, a presença de drogas. A região H do genoma de Leishmania (Leishmania) major é um dos loci mais estudados que leva à amplificação em resposta a drogas não relacionadas, como a terbinafina. Foram isoladas linhagens de L. (L.) major e Leishmania (Viannia) braziliensis resistentes à terbinafina. Análises por corridas curtas de eletroforese em campo pulsado (PFGE) e Southern blotting revelaram que a resistência observada nestas linhagens não foi gerada pela amplificação do locus H. Sendo assim, a resistência ao inibidor da esqualeno epoxidase está sendo gerada por um outro mecanismo uma vez que outros loci podem estar envolvidos na resistência à terbinafina e através da análise diferencial do perfil de proteínas, os mutantes resistentes apresentaram diferenças na expressão de proteínas. O alvo inicial para a elucidação da resistência à terbinafina nas linhagens selecionadas foi a via de biossíntese de ergosterol. Foram escolhidos os genes da 3-cetoacil-CoA tiolase (ERG10), esqualeno sintase (ERG9 ou SQS1), esqualeno epoxidase (ERG1), oxidoesqualeno-lanosterol ciclase (ERG7) e lanosterol 14-demetilase (ERG11), de L. major e L. braziliensis, além do gene YIP1 de L. braziliensis. Para isso foram sintetizados oligonucleotídeos a partir das seqüências geradas pelo projeto genoma destas espécies depositadas em bancos de dados. Os genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 e ERG11 de L. major e de L. braziliensis além do YIP1 de L. braziliensis amplificados por PCR foram clonados no vetor pGEM-T Easy, que possibilitou a construção de reagentes para ruptura de todos genes pela inserção da marca HYG e, com exceção do gene ERG7 de L. braziliensis, os genes foram subclonados no vetor pXG1. Fragmentos de restrição dos genes clonados no vetor pGEM-T Easy foram utilizados para analisar o nível de seus transcritos por northern blot. Também verificamos através de corridas curtas de PFGE e análises de Southern, que as linhagens em estudo não apresentam amplificação dos loci em estudo. A participação de genes da via de biossíntese de ergosterol de L. major e L. braziliensis e do gene YIP1 de L. braziliensis na resistência ou susceptibilidade à terbinafina e/ou anfotericina B foi verificada através de experimentos funcionais. Com esse objetivo, os genes YIP1, ERG10 e ERG1 de L. braziliensis foram transfectados na linhagem LB2904 de L. braziliensis, e os genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 e ERG11 e a ruptura do gene ERG1 pelo cassete HYG de L. major foram transfectados na linhagem LT252 de L. major. Foram realizados experimentos para analisar a susceptibilidade à anfotericina B associada ou não à terbinafina, das linhagens selvagens de L. major e L. braziliensis, e a partir destes experimentos iniciais, foram selecionadas linhagens destas duas espécies resistentes à anfotericina B. Para analisar a possível função regulatória dos elementos RIME 5/2/6 de L. braziliensis, foi feita a amplificação por PCR da repetição invertida LbRIME 5/2/6b que permitiu a clonagem deste fragmento no vetor pGEM-T Easy e a sua ruptura pela marca SAT. A clonagem no vetor pGEM possibilitou a análise da interação de proteínas nucleares à repetição LbRIME 5/2/6b através do gel shift.