Mecanismo molecular envolvido na regulação de um gene codificador de bomba de efluxo de fármacos no dermatófito Trichophyton rubrum - Lopes, Marcos Eduardo Ramos (2021)
Dermatófitos são fungos que causam uma variedade de micoses de pele, cabelos, pelos e unhas em animais e humanos. Eles acometem tecidos queratinizados provocando dermatofitoses, como a causada pelo patógeno humano Trichophyton rubrum. O tratamento da infecção fúngica é desafiador, pois o fungo pode apresentar resistência aos antifúngicos. As bombas de efluxo, presentes na membrana celular, fazem o efluxo de diferentes antifúngicos, sendo um mecanismo frequentemente associado à resistência a múltiplas drogas (MDR - multidrug resistance). Além disso, os fungos podem realizar ajustes finos via splicing alternativo (SA) como estratégia adaptativa frente a diferentes estímulos. A retenção de íntron (RI) é um tipo de SA, e parece ser o mais frequente em Ascomycetos. Dessa forma, o objetivo desse projeto foi investigar a ocorrência de SA em genes que codificam para proteínas transportadoras MDRs em T. rubrum após exposição a drogas antifúngicas. Dados de RNA-Seq de T. rubrum em resposta aos antifúngicos ácido undecanóico e acriflavina foram utilizados para a triagem destes genes. O gene identificado como TERG_04309 que codifica um transportador ABC se destacou por apresentar um número expressivo de RI 3 e 4. Subsequentemente, foram realizados cultivos de T. rubrum na presença dos antifúngicos Ácido Undecanóico (UDA), Caspofungina (CASP), Itraconazol (ITR) e Terbinafina (TRB) e a modulação das isoformas da TERG_04309 foi avaliada por RT-PCR e RT-qPCR, com o objetivo de verificar se este fenômeno se aplicaria a outros fármacos de diferentes mecanismos de ação. Resultados de RT-qPCR demonstraram a indução da isoforma com o íntron-3 retido após 12 h de exposição ao ITR e a indução da isoforma com íntron-4 retido, após 1h e 12 h de exposição a CASP. Foi observado também a indução proeminente da isoforma convencional após exposição do fungo a TRB e ITR. Paralelamente, genes que putativamente interagem com TERG_04309 tiveram suas modulações avaliadas. Um deles, a TERG_04224, que também codifica uma bomba de efluxo teve sua expressão induzida nas condições de 1h CASP e 12h ITR. Isto indica a co-expressão de TERG_04309 e TERG_04224. Em muitos casos, a RI desencadeia proteínas truncadas e com perdas de domínios, assim seria concebível que as isoformas provenientes de SA fossem não funcionais. Entretanto, o alinhamento das isoformas alternativas com proteínas ortólogas mostra semelhanças entre elas, o que sugere que as isoformas oriundas da RI do gene TERG_04309 podem manter suas funções, com prováveis alterações na afinidade e efetividade na extrusão. Adicionalmente, a modulação das isoformas de TERG_04309 foi avaliada em biofilmes maduros de T. rubrum após exposição às drogas CASP e TRB por 1h. Foi evidenciada a indução de ambas as isoformas alternativas após a exposição à CASP, sugerindo que elas têm função no efluxo de drogas. Portanto, os presentes resultados indicam que o T. rubrum tem respostas tempo e composto-específicos, que envolve além dos mecanismos regulatórios convencionais, um mecanismo alternativo proveniente de SA, que ocorre tanto nas fases de crescimento planctônico como na forma de biofilmes.