Seqüências ORESTES (open reading frame expressed sequence tags) de trypanosoma cruzi e transcrição de DNA satélite - Martins, Camila Augusta de Oliveira (2008)
Nos bancos de dados de T. cruzi há cerca de 3.750 ESTs de amastigotas e tripomastigotas, seqüenciadas a partir das extremidades 5\' ou 3\' de clones de cDNA. A metodologia ORESTES (Open Reading Frame Expressed Sequence Tags) possibilita obter seqüências transcritas parciais derivadas majoritariamente da porção central dos mRNAs, favorecendo a descoberta de novos genes. Neste trabalho, caracterizamos ORESTES de formas infectantes amastigotas e tripomastigotas da cepa humana VL10 (ATVL). A metodologia foi padronizada com formas epimastigotas da cepa CL Brener (ECL), monitorando-se nas preparações de mRNA a contaminação por DNA e a integridade dos transcritos. Populações de cDNA foram obtidas utilizando-se diferentes iniciadores aleatórios. O mesmo iniciador foi empregado nas etapas de RT e PCR, realizada em condições de baixa estringência. Obtivemos 776 e 1522 ORESTES de ECL e ATVL, respectivamente. Após análise com o programa PHRED, aceitaram-se 745 ORESTES de ECL e 1476 de ATVL. As ORESTES apresentaram um tamanho médio de 680 pb e um conteúdo de G+C de 53%. O agrupamento com CAP3 gerou 463 agrupamentos de ECL (360 singletons e 103 contigs) e 454 de ATVL (337 singletons e 117 contigs). A anotação foi feita utilizando-se o programa BLAST contra o banco nr do NCBI. Na biblioteca de ATVL observamos um número elevado de seqüências de RNA ribossômico (27%), amplificadas preferencialmente por dois iniciadores. Para ECL, a contaminação por rRNA foi de 3,6%. Para cerca de 50% das ORESTES de ATVL (n= 729) foi encontrada similaridade em bancos de dados de proteínas. Destas, 316 apresentaram similaridade com proteínas putativas conhecidas e 413 foram anotadas como proteínas hipotéticas e hipotéticas conservadas. Para 87 ORESTES de ATVL (5,9%) não foi observada nenhuma similaridade. 628 ORESTES de ECL (84%) apresentaram similaridade com proteínas depositadas em bancos públicos, ao passo que nenhuma similaridade foi encontrada para 18 cDNAs (2,4%). Ensaios de Southern blot confirmaram a presença de 4 ORESTES no match analisadas nos genomas das duas cepas. Não puderam ser atribuídas a processos biológicos conhecidos 39% e 68% das seqüências dos contigs de ECL e ATVL, respectivamente. Nos processos de Proteólise e Peptidólise, estão incluídas 11% das ORESTES de ECL e 0,3% das ORESTES de ATVL. Outras diferenças funcionais putativas foram observadas. A abundância diferencial dos transcritos de algumas ORESTES foi analisada por northern blot nos estágios evolutivos das cepas. Southern blot do contig ATVL95 originou um padrão de hibridização com múltiplas bandas, característico de seqüências repetitivas. Este contig corresponde ao transcrito do DNA satélite de 195 pb (195 SAT), uma seqüência repetitiva que perfaz cerca de 10% do genoma de T. cruzi e cuja transcrição é controversa na literatura. A transcrição do 195 SAT foi comprovada por experimentos de + northern blot e por RT-PCR. Transcritos de 195 SAT foram detectados nas frações de RNA de poliA+ e poliA-. Esses transcritos não conteriam a seqüência SL, presente nos mRNAs de tripanossomatídios. e poliA Utilizando oligonucleotídios complementares às duas fitas de 195 SAT concluímos que ambas são transcritas. Embora esteja claro que 195 SAT é transcrito, sua função biológica permanece desconhecida.