Efeito de mutações no gene TrkA encontradas na insensibilidade à dor congênita sobre vias de sinalização celular - Moraes, Beatriz Caroline de (2020)
A insensibilidade congênita à dor e anidrose (CIPA), uma desordem genética autossômica recessiva, é caracterizada por episódios recorrentes de febre inexplicável, anidrose, retardo mental e principalmente pela falta de percepção da dor sensorial, devido à ausência de fibras sensitivas primárias dependentes de NGF e de neurônios simpáticos pós ganglionares. Mutações que causam perda de função do receptor de tropomiosina quinase A (TrkA) estão entre os principais fatores que levam à doença. O TrkA é um receptor de alta afinidade pelo NGF, e a formação do complexo NGF/TrkA tem papel no desenvolvimento neuronal, bem como na sensibilização para percepção de aumento de temperatura e de estímulo mecânico, que resulta em hiperalgesia. Muitas mutações compõem o espectro da síndrome da CIPA, entre elas, as localizadas no domínio quinase do TrkA são o alvo desse estudo, pois estas podem alterar o funcionamento da quinase e, assim, interferir em importantes vias de sinalização celular (PLCγ, Akt e ERK). Com o objetivo de compreender como as vias de sinalização são alteradas pelas mutações em TrkA na CIPA, através da análise de artigos publicados no PubMed, identificamos 131 mutações diferentes neste gene. As mutações missense foram localizadas na estrutura tridimensional e classificadas em três classes (1) mutações próximas ao local de ligação da ATP (sítio catalítico), (2) mutações no local de ligação ao substrato (SBS) e (3) mutações em outras regiões estruturadas do TrkA que poderiam impedir o enovelamento correto da proteína. Validamos in vitro uma das mutações de CIPA (R654C), classificada tanto como mutação no sítio deligação de ATP quanto na região de SBS. Como previsto nas modelagens, essa mutação apresentou inativação total da TrkA. As mutações nonsense e frameshift também afetariam significativamente a estrutura da TrkA, porém, embora algumas delas como Q770*, Q782*, V777Cfs*91 e L784Sfs*79, fariam com que uma proteína truncada fosse expressa afetando especificamente a ancoragem de PLCγ sua presença desencadeou o fenótipo de CIPA nos pacientes, indicando que a ativação de PLCγ seria uma importante via para a ocorrência da dor. Baseado nestes achados, foi desenvolvido um peptídeo que inibe a interação do TrkA e PLCγ, denominado QYP. Em células HEK 293 transfectadas com TrkA, QYP foi capaz inibir a ativação de PLCγ mediada por NGF. Ainda, em ensaios comportamentais in vivo de dor inflamatória aguda e crônica induzida por CFA, QYP foi capaz de inibir a hipersensibilidade mecânica e parcialmente a térmica causada pela inflamação por até 6 horas. QYP também se mostrou mais eficiente que inibidores comerciais (GNF,inibidor de TrkA e U73347,inibidor de PLC) na reversão da sensibilidade dolorosa. Com base nos nossos resultados, validamos que a via de PLCγ é essencial para o desenvolvimento de dor mecânica, sendo essa via um alvo em potencial para o desenvolvimento de novos analgésicos. Ainda, o peptídeo QYP mostrou-se efetivo na reversão da sensibilidade dolorosa aguda e crônica em modelos in vivo de dor inflamatória.