Efeitos da expressão de microRNA-31 induzida por concentração elevada de glicose sobre a migração e adesão de fibroblastos. - Gomes, Cibele Crastequini (2021)
Diabetes Mellitus (DM) é uma doença complexa, caracterizada pela hiperglicemia crônica. Muitas complicações estão associadas ao DM duradouro, dentre elas a cicatrização deficiente de feridas. O estresse oxidativo é um dos principais mecanismos envolvidos nas complicações do DM. Demonstramos previamente que células expostas a uma concentração elevada de glicose (HG) apresentam menor velocidade, maior número de protrusões celulares simultâneas e não produtivas (retráteis) e direcionalidade reduzida, por mecanismos que envolvem agentes oxidantes. MicroRNAs são reguladores pós-transcricionais da expressão gênica que promovem a degradação de mRNAs alvo, ou bloqueiam sua tradução. Alguns microRNAs podem afetar a migração celular, como o miR-31. A expressão de miR-31 está aumentada em fibroblastos sob condições hiperglicêmicas (in vivo e in vitro), por mecanismos relacionados ao estresse oxidativo. A superexpressão de miR-31 em fibroblastos aumentou o número de protrusões celulares improdutivas e simultâneas e reduziu a direcionalidade de migração, sem afetar a velocidade celular. O objetivo deste estudo foi elucidar os mecanismos pelos quais o miR-31 afeta a migração de fibroblastos em condições que simulam, in vitro, a normoglicicemia e a hiperglicemia. Para isso, fibroblastos da linhagem NIH-3T3 foram cultivados em baixa concentração de glicose (5 mM) ou HG (30 mM) durante 3 dias. O papel de espécies reativas de oxigênio (EROs) na migração foi avaliado com a adição do antioxidante N-acetil cisteína (NAC) ao meio. Experimentos funcionais foram realizados após superexpressão (com miR mimic) ou supressão (com anti-miR) de miR-31-5p. A expressão de miR-31 foi estudada por PCR em tempo real e o comportamento migratório foi avaliado por time-lapse. A dinâmica de adesões (número, tamanho, circularidade, classificação e localização) foi estudada por microscopia TIRF em células transfectadas com paxilina fluorescente. A expressão de alvos potenciais foi estudada por western blotting e a validação dos alvos foi feita por ensaios de luciferase. Os resultados mostraram que a supressão de miR-31 reduziu a velocidade celular e aumentou a direcionalidade de migração, aumentando a estabilidade de protrusões e a formação de feixes contráteis de actina e miosina II. Semelhante à HG, a superexpressão de miR-31 reduziu o número e tamanho das adesões, com predominância de adesões nascentes (imaturas) sobre a fibronectina. A supressão de miR-31 promoveu a maturação das adesões, aumentando o número e tamanho de adesões focais, sem influenciar a formação de novas adesões. HG reduziu a expressão de ROCK1 e Radixina, sem alterar ROCK2 e integrina 5, por mecanismo dependente de EROs. A superexpressão de miR-31 reduziu a expressão de ROCK1, ROCK2 e Radixina, enquanto a supressão de miR-31 teve o efeito contrário. Radixina foi identificada como alvo direto de miR-31, enquanto ROCK1 foi identificada como alvo indireto. Conclusão: A expressão aumentada de miR-31 em fibroblastos expostos a uma concentração elevada de glicose, estimulada por EROs e tendo como alvos a Radixina (direto) e ROCK1 (indireto), prejudica a migração por diminuição da maturação de adesões celulares junto à matriz extracelular, causando uma perda na estabilidade dos lamelipódios e diminuição da persistência direcional da migração, além de reduzir a contratilidade celular.