Modelagem e otimização matemática do processo de produção daproteína recombinante Amblyomin-X pela bactéria Escherichia coli BL21(DE3) mutada - Marteleto, Natália Bonifácio (2020)
Amblyomin-X (Amblyomma cajennense inhibitor of Factor Xa) é uma proteína encontrada nas glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajennense que inibe o Fator Xa da cascata de coagulação sanguínea. Ao ser expressa em Escherichia coli BL21(DE3), estudos mostraram que essa proteína induziu a apoptose em algumas células tumorais, tais como melanoma e carcinomas de pâncreas e renal. Com esses resultados, maiores quantidades de proteína foram requeridas e o desenvolvimento do processo de produção em maior escala foi necessário. A partir de um protocolo do processo de produção da proteína bem estabelecido, este trabalho de doutorado direto tem como objetivo otimizar a concentração celular obtida no momento anterior à indução da proteína heteróloga por meio da proposição de um modelo matemático fenomenológico não-estruturado que represente o processo e compreender, por meio da análise de fluxos metabólicos, a dinâmica do metabolismo E. coli no seu crescimento e na biossíntese da proteína. Trinta e oito ensaios foram realizados em biorreatores de 15 L no intuito de compreender os fenômenos envolvidos no processo de crescimento da bactéria e produção da proteína heteróloga de interesse. Desses ensaios, dez foram tomados para a proposição do modelo fenomenológico e ajustar os seus parâmetros. Um modelo fenomenológico do processo de produção da Amblyomin-X composto por 14 variáveis de estado, 1 equação de transporte de indutor do meio extracelular para o meio intracelular, 1 equação cinética de crescimento celular e 1 equação cinética de produção da proteína foi proposto e simulado utilizando o software Matlab®. O ajuste de parâmetros do modelo foi realizado em linguagem Fortran e validado Estatisticamente através do Teste-F. O modelo foi aprovado nesse teste estatístico e foi empregado para alimentar o otimizador em Matlab® visando maximizar a concentração celular no momento anterior à indução (produção de proteína associada ao crescimento). Empregando perfil de vazão de alimentação resultante da otimização, foi possível atingir a concentração de 30,25 g/L de células no biorreator. Para a compreensão do metabolismo da E. coli e análise de fluxos metabólicos, um ensaio (dentre os 38 demais) foi realizado com maior número de amostragens. A análise de fluxos metabólicos foi realizada utilizando o software Metatool e o software Matlab®, resultando em três conjuntos de modos de fluxos elementares. A partir desses modos elementares, foram geradas três diferentes fotografias, que representam o metabolismo da bactéria ao longo do processo de produção da proteína. A comparação entre tais fotografias mostra que não existem mudanças significativas na distribuição de fluxos nas vias do metabolismo central da bactéria ao longo do processo. A compreensão e a estimativa do fluxo de carbono a partir da velocidade de respiração microbiana também permitiu a proposição de outro modelo matemático para o monitoramento da produção de ácido acético em tempo real.