Organogênese in vitro e transformação genética em Citrus sp. com o gene da capa protéica e uma seqüência conservada antisense do vírus da tristeza dos citros - Schinor, Evandro Henrique (2006)
O presente trabalho teve como principal objetivo obter plantas transgênicas, dos cultivares porta-enxerto limão \'Cravo\' e laranja azeda e de cultivares copa de laranja doce, expressando genes que possam influenciar no nível de resistência ao vírus da tristeza dos citros (CTV) e, possivelmente à morte súbita dos citros. Buscou-se ainda estudar a organogênese in vitro de espécies cítricas. Experimentos para a indução da organogênese in vitro foram realizados a partir de segmentos de epicótilos de plântulas germinadas in vitro de espécies cítricas avaliando-se: a resposta organogênica de três diferentes regiões do epicótilo, na presença (1,0 mg.L-1) ou ausência de BAP, em meio MT, e a regeneração em diferentes concentrações de BAP (0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg.L-1) adicionadas ao meio MT. Também avaliou-se a regeneração de segmentos internodais de limão ?Cravo? e laranja azeda em diferentes concentrações de BAP (0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg.L-1) em meio MT; e de laranja azeda em meio de cultura MT e DBA3, suplementados com diferentes concentrações de BAP (0; 1,0 e 2,0 mg.L-1) e ANA (0; 0,3 e 0,5 mg.L-1). Foi utilizado o método de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens utilizando-se tecido juvenil coletado de plantas cultivadas in vitro (segmentos de epicótilo) ou em casa de vegetação (segmentos internodais) como explantes. Utilizou-se a estirpe EHA105 de A. tumefaciens, contendo os plasmídeos: a) pCTV-CP: contendo o gene da capa protéica do CTV; b) pCTV-dsCP: contendo repetições invertidas do gene da capa protéica do CTV, interligadas pelo intron do gene da quitinase de citros; c) pCTVcons: contendo uma seqüência conservada antisense do CTV. As construções gênicas foram elaboradas a partir do plasmídeo pCAMBIA 2201, dirigidas pelo promotor 35S e o terminador NOS. Foram utilizados também os genes de seleção nptII e o repórter GUS. As gemas adventícias desenvolvidas foram identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS e por PCR e a confirmação da transformação genética foi feita por Southern Blot. A expressão da proteína do CTV foi verificada pelo teste serológico de PTA-ELISA. A resposta morfogênica em função da região do epicótilo e das concentrações da citocinina BAP é dependente do cultivar de citros. A suplementação do meio de cultura com a citocinina BAP proporcionou um maior número de gemas adventícias regeneradas por explante, tanto em segmentos de epicótilo como em segmentos internodais dos cultivares de citros estudados. A suplementação do meio de cultura com a citocinina BAP é essencial na regeneração de gemas adventícias em segmentos internodais de laranja azeda. Foi possível regenerar plantas transgênicas, pelo protocolo de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens de limão \'Cravo\' contendo o gene da capa protéica do vírus da tristeza dos citros (pCTV-CP) utilizando-se segmentos de epicótilo e segmentos internodais como fonte de explante, e com uma seqüência conservada antisense do CTV, utilizando-se segmentos internodias; e de laranja \'Hamlin\' contendo o gene da capa protéica do CTV, com as construções gênicas pCTV-dsCP e pCTV-CP, e com uma seqüência conservada antisense do CTV, utilizando-se segmentos de epicótilo como fonte de explante.