Análise em larga escala global e de compartimentos celulares utilizando abordagens proteômicas e moleculares para avaliar o efeito antiproliferativo de FGF2 em células Y1 - Vitorino, Francisca Nathália de Luna (2022)
O fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) apesar de induzir proliferação celular em diversos contextos, inibe irreversivelmente a proliferação de células tumorais com o oncogene k-ras superexpresso, como nas células Y1, na transição G2/M do ciclo celular. Para entender melhor o mecanismo molecular induzido por este fator, objetivamos entender como o proteoma da célula está respondendo a esse estímulo. Propusemos analisar por proteômica quantitativa as alterações induzidas por FGF2, no extrato total, na cromatina, nucléolo e nos loci de rDNA. No proteoma total, mais de 2900 proteínas foram quantificadas, indicando que os termos associados ao metabolismo, processamento de RNA, replicação e transcrição estão enriquecidos entre as proteínas diferencialmente expressas no estímulo com FGF2. A análise da rede reguladora de transcrição indica os membros de AP-1 (principalmente FosB), como reguladores principais da sinalização de FGF2. A expressão de JunB começa após 1 h do estímulo com FGF2 e atinge o pico após 5 h, a expressão de FosB após 3 h a 24 h, com pico de 3 h a 8 h. Ambos os níveis de abundância dessas proteínas dependem do receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR) e da sinalização src. O knockdown de JUNB e FOSB não resgata as células da parada de crescimento induzida por FGF2; no entanto, o knockdown do FOSB resgata as células do atraso na replicação do DNA, indicando que a abundância do FOSB está subjacente ao atraso na progressão da fase S. No proteoma da cromatina, mais de 5000 proteínas foram identificadas, sendo mais de 300 proteínas down reguladas após o estímulo com FGF2 por 24 h, incluindo diversas proteínas associadas a RNA polimerase II. Foi demonstrado uma modulação da transcrição global pelo estímulo com FGF2, através de ensaio de run-on, apresentando efeitos opostos em tempos curtos e longo de estímulo. No proteoma nucleolar, mais de 1200 proteínas foram identificadas, indicando que termos associados a transcrição, processamento de rRNA e biogênese de ribossomos estão enriquecidos entre as proteínas diferencialmente expressas por FGF2. Diversas proteínas pertencentes a complexos remodeladores da cromatina estão diferencialmente expressas no nucléolo após o estímulo com FGF2, sugerindo uma modulação do estado transcricional do rDNA. Foi identificado aumento nos transcritos de rRNA imaturo após o estímulo com FGF2 por 24 h, podendo ser um indício de aumento da transcrição ou da atividade da RNA Polimerase I. No entanto, os ribossomos maduros parecem não estar sendo afetados e há uma desorganização nucleolar, observada através da dispersão da marcação da fibrilarina, após o estímulo com FGF2. No proteoma dos loci de rDNA, 556 proteínas foram identificadas, sendo 27 diferencialmente expressas após o estímulo com FGF2. Dentre essas proteínas destacamos as proteínas Nolc1 e Tcof1, que dentre outras funções, participam do processamento do rRNA, principalmente no que concerne a modificações pós-transcricionais de rRNA, e modulação dos ribossomos. Em conjunto, esses resultados demostram que o estímulo antiproliferativo de FGF2 dispara alterações transcricionais importantes, desde a superativação de genes de reposta imediata, até a modulação do principal sítio de transcrição celular, o nucléolo, modulando diretamente o rDNA.