Estudo da termoestabilidade de uma endoxilanase GH11 recombinante através da mutagênese sítio-dirigida - Alponti, Juliana Sanchez (2011)
As xilanases (endo-β-1,4-xilanohidrolases, EC 3.2.1.8) são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações β-1,4 glicosídicas da xilana, um polissacarídeo presente na parede celular vegetal, liberando oligômeros menores do açúcar redutor. As xilanases podem ser utilizadas em diversas aplicações biotecnológicas, como na fabricação de ração animal, sacarificação da biomassa, indústrias têxteis e de papel. No entanto, a utilização de enzimas em processos industriais é realizada em elevadas temperaturas, as quais a maioria das enzimas disponíveis naturalmente não suportam. Desta forma, estudar os mecanismos pelo quais algumas proteínas possuem estabilidade em elevadas temperaturas têm despertado grande interesse para pesquisas básicas que visam estabelecer os determinantes estruturais responsáveis pela termoestabilidade protéica. Estudos prévios de simulação dinâmica molecular foram realizados por colaboradores para investigar a termoestabilidade de um par mesofílico-termofílico de endoxilanases da família GH11. No estudo, a comparação das energias dos resíduos de aminoácidos homólogos entre as duas xilanases, sugeriu que a interação com o solvente exerce importante papel na termoestabilidade apresentada por esta família de enzimas. Além disso, comparando-se as estruturas das xilanases, pôde-se observar que alguns resíduos formaram ligações de hidrogênio altamente estáveis e que 14 deles (presentes na xilanase termofílica) não apresentam correspondentes na mesofílica, sendo considerados candidatos para mutagênese sítio-dirigida visando melhorar a termoestabilidade da xilanase mesofílica. Dos 14 resíduos investigados por simulação dinâmica molecular, 5 deles (22, 27, 32, 54 e 181) estão localizados no domínio \"dedos\" da xilanase, região em que os aminoácidos estão em contato direto com o solvente. No trabalho atual, 5 mutantes do domínio \"dedos\" identificados por simulação dinâmica molecular (S22E, S27E, N32D, N54E e N181R) foram construídos através da técnica de mutagênese sítio-dirigida, foram expressos em células E. coli (BL21) e purificados por cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC), utilizando-se um resina de níquel. A análise da estrutura secundária das proteínas foi analisada por dicroísmo circular (DC) e revelou a perda de estrutura para o mutante N181R, que por esse motivo foi excluído dos testes que envolveram a caracterização bioquímica e biofísica. Os espectros de DC dos outros mutantes tiveram perfis semelhantes ao perfil apresentado pela proteína nativa recombinante, com mínimo em 218 nm e máximo próximo a 198 nm. A caracterização bioquímica foi realizada através de ensaios de atividade xilanásica e determinou a temperatura e pH ótimos dos mutantes, assim como o tempo de meia vida (T1/2) para todas as proteínas. Os dados obtidos mostraram que todos os mutantes mantiveram a temperatura ótima da proteína selvagem (em 55ºC). Foi observado que os mutantes S22E, N32D e N54E possuem maior atividade específica que a proteína nativa recombinante. Os testes de pH mostraram que somente o mutante S27E deslocou o pH ótimo para região mais ácida (pH 6,0) e que os outros mutantes tiveram o pH ótimo deslocado para pH mais alcalinos. O mutante S22E deslocou o pH ótimo para a faixa entre 6,5 e 7,0; o mutante N32D apresentou o maior deslocamento de pH ótimo, entre 7,0 e 7,5; e finalmente o mutante N54E teve o pH ótimo deslocado para 7,0. Finalizando os estudos bioquímicos, realizou-se o teste de termotolerância, o qual revelou que o mutante S22E foi o mais termotolerante, mantendo 50% da atividade específica por 16 minutos a 55ºC, o dobro do observado para a proteína nativa recombinante. Para estimar os parâmetros termodinâmicos das proteínas mutantes, utilizou-se a técnica de desnaturação térmica monitorizada por dicroísmo circular acoplada a um sistema Peltier. A utilização dessa técnica possibiliotu a determinação dos valores da entalpia de desnaturação van\'t Hoff (ΔHNU), temperatura de fusão (Tm) e capacidade térmica em pressão constante (ΔCp), para as proteínas tipo selvagem e mutantes. Esses dados demonstraram que as proteínas mais e menos termotolerantes, S22E e S27E, foram as que apresentaram maior e menor valores de ΔCp, respectivamente.