Caracterização dos efeitos do Amblyomin-X sobre a angiogênese e a célula endotelial - Dias, Rodrigo Yukio Shiroma (2010)
A proteína recombinante inibidora de serinoprotease denominada de Amblyomin-X foi obtida a partir de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajannense, construída e utilizada para identificar um gene que codifica um inibidor de serinoprotease do tipo Kunitz. O Amblyomin-X inibe a formação da massa tumoral in vivo, no entanto o mecanismo envolvido neste efeito não está totalmente esclarecido. Visto que um dos mecanismos anti-carcinogênicos dos inibidores de serinoproteases é a inibição do processo de angiogênese, este trabalho foi delineado para avaliar as ações do Amblyomin-X sobre a angiogênese in vivo e sobre funções da célula endotelial envolvidas neste processo. A angiogênese in vivo foi estudada em modelo de câmara dorsal por microscopia intravital. Quarenta e oito horas após a implantação da câmara dorsal, os animais receberam tratamento tópico de salina ou de Amblyomin-X por 8 dias, com intervalos de 48 horas a cada dose (10, 100 ou 1000ng/mL). Os efeitos foram avaliados em condições basais e na vigência do crescimento tumoral (injeção de 1x105 células B16-F10 de melanoma murino no tecido subcutâneo). Adicionalmente, os efeitos do Amblyomin-X sobre a permeabilidade vascular foram avaliados pela mensuração espectrofotométrica da quantidade de corante extravasado no tecido dos animais após injeção intradérmica do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) ou do Amblyomin-X. Uma série de estudos in vitro foram realizados em células endoteliais de linhagem de microcirculação (t-End) para avaliar os efeitos do Amblyomin-X (10, 100 e 1000ng/mL) sobre: 1) a migração destas células, usando modelos bidimensional (2D) de cicatrização in vitro e tridimensional (3D) em câmara de Boyden modificada, na ausência e frente ao fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF; 100 ng/mL); 2) sobre a aderência em Matrigel® e 3) sobre a secreção de prostaglandina E2 (PGE2) e a produção de óxido nítrico (NO) por ensaio imunoenzimático e reação de Griess, respectivamente. Ademais, foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X sobre a viabilidade das células B16-F10 (1x105) por citometria de fluxo. Os resultados obtidos mostram que a aplicação tópica de Amblyomin-X reduziu o número de vasos no tecido subcutâneo dorsal (10ng/mL = 21,7%; 100ng/mL= 35,7%; 1000ng/mL= 36,8% vs 1° dia de tratamento). O mesmo efeito foi observado na presença de células B16-F10 (1000ng/mL= 44,3% vs 1° dia de tratamento), além de uma redução no desenvolvimento da massa tumoral (1000ng/mL= 88% vs controle). O tratamento com Amblyomin-X reduziu a migração basal das células t-End no modelo 2D (10ng/mL=16,4%; 1OOng/mL=23, 1%; 1000ng/mL=26,8% vs controle) e 3D (10ng/mL=39,2%; 100ng/mL=49,4%; 1000ng/mL=50,4% vs controle); inibiu a adesão destas células endoteliais em Matrigel® (100ng/mL=46,4%; 1000ng/mL=48,4% vs controle); não alterou produção os mediadores químicos NO e PGE2 pelas células endoteliais; não modificou a permeabilidade vascular e não alterou a viabilidade das células de melanoma murino B16-F10. Em conjunto, os dados obtidos mostram que o Amblyomin-X inibe a formação de novos vasos em condições basais e na vigência de crescimento tumoral in vivo que este efeito pode estar relacionado à redução do desenvolvimento tumoral, uma vez que a concentração de Amblyomin-X que inibe a angiogênese não causou citotoxicidade às células tumorais in vitro. Além disso, os mecanismos envolvidos no processo de angiogênese podem ser decorrentes, pelo menos em parte, de prejuízos na migração e adesão das células endoteliais.