Caracterização molecular das enzimas desubiquitinadoras 7 e 12 durante o ciclo de vida do parasita Schistosoma mansoni - Andreolli, Andressa Barban do Patrocínio (2005)
A via de modificação pós-traducional dependente de ubiquitina direciona a regulação de diversos processos biológicos tais como, controle do ciclo celular, ativação da transcrição, transdução de sinal e proteólise intracelular dependente do proteassoma 26S. A conjugação e a ativação da molécula de Ubiquitina (Ub) envolvem três enzimas distintas: a enzima ativadora (E1), dependente de ATP, conjugadora (E2) e a ligase (E3). Esse processo é reversível, sendo regulado pelas enzimas envolvidas na conjugação e também por enzimas chamadas desubiquitinadoras (DUBs). Essas últimas clivam a ligação isopeptídica entre as ubiquitinas que formam a cadeia poliubiquitinada, mantendo o pool livre de Ub intracelular; clivam a ligação entre a Ub e o substrato mono ou poliubiquitinado; e processam a pré-proteína, dando origem a forma madura de Ub. As enzimas desubiquitinadoras são divididas em cinco famílias: as ubiquitinas C-terminal hidrolases (UCHs), proteases específicas para ubiquitina (USPs), otubaínas, proteases ataxina3/josephim e isopeptidases do tipo JAMM. Dentro desse contexto, o nosso trabalho teve como objetivo determinar as diferentes DUBs presentes em S. mansoni, através de análises de bioinformática no banco de dados do Projeto Genoma do Schistosoma, as quais mostraram a existência de 32 clusters relacionados a essas enzimas; sequenciar, caracterizar e analisar a expressão dos genes que codificam para as enzimas DUB7 e DUB12 nesse parasita. Foram utilizados oligonucleotídeos iniciadores gene-específicos, idealizados com base nos clusters SmAE 604756 e 602388, para amplificar um produto com 800 e 736 pb, através da técnica de RT-PCR, da fase de verme adulto. Depois disso, foi extraído o RNA total das diversas fases do parasita (esporocistos mãe e filho, ovos, esquistossômulos de 3 horas, e cercárias) e procedemos à técnica de RT-PCR. Para SmDUB7 obtivemos um padrão de expressão, mas para a SmDUB12 a técnica de RT-PCR não possibilitou amplificar os cDNAs para esquistossômulos e ovos devido aos baixos níveis de transcritos. O tamanho da mensagem codificadora, bem como o perfil da população de mRNA em verme adulto foi verificado, utilizando a técnica de Northern Blot. Para SmDUB7 obtivemos uma banda de 5,46Kb e para a SmDUB12 uma banda de 1,7Kb. Para determinar o perfil genômico desses dois genes em parasitas adultos, foram utilizadas as técnicas de PCR e Southern Blot. O resultado da sequência genômica, para o fragmento do gene SmDUB7, mostrou não haver interrupções por regiões não codificadoras na região codificadora analisada. Por outro lado, a SmDUB12 mostrou que o fragmento gênico correspondente a região codificadora é interrompida por pequenas regiões não codificadoras o que é uma característica do genoma de S. mansoni, descrita anteriormente para outros genes do parasita. A técnica de Southern Blot mostrou que existe apenas uma cópia desse gene por genoma haplóide nesse parasita para a SmDUB12. Esses dados juntamente com outros resultados obtidos pelo nosso grupo, apontam para a forte evidência de que ciclos de ubiquitinação/desubiquitinação podem estar envolvidos em processos celulares críticos durante um ciclo biológico completo do S. mansoni. No entanto, podemos ressaltar que esta caracterização inicial constitui uma abordagem pioneira no estudo destas enzimas em parasitas helmintos.