Expressão de subunidades P2X em células de Leydig de camundongos em diferentes idades e interações entre as subunidades P2X2, P2X4 e P2X6 formadoras de receptores funcionais - Antonio, Ligia Subitoni (2012)
A maturação sexual em mamíferos resulta da interação entre diversos sinais celulares, controlados por genes relacionados ao sexo e hormônios produzidos pela Hipófise e gônadas. As células de Leydig, situadas no interstício dos testículos, são responsáveis pela produção de Testosterona e estimuladas principalmente pelo Hormônio Luteinizante. O tratamento dessas células com ATP extracelular induz aumento do cálcio intracelular ([Ca2+]i) e, consequentemente, um aumento na secreção de Testosterona. Esse influxo de cálcio ocorre via ativação de Receptores Purinérgicos P2X. Até o momento, sete subunidades de receptores P2X foram identificadas, P2X1 - P2X7, que interagem na forma de trímeros: homoméricos (subunidades iguais) ou heteroméricos (subunidades diferentes). Cada arranjo de subunidades apresenta características distintas. Atualmente, seis receptores heteroméricos foram descritos, entre eles P2X2/6 e P2X4/6, porém nenhum envolvendo três subunidades diferentes. Além disso, algumas subunidades não apresentam interações entre si, como as subunidades P2X2/P2X4. Estudos eletrofisiológicos sugerem a presença de receptores heteroméricos P2X2/4/6 em células de Leydig de camundongos adultos. O aumento da [Ca2+]i, decorrente do influxo deste íon através de receptores P2X, pode indicar uma via de modulação da Esteroidogênese. Além da dependência de cálcio, o processo esteroidogênico é influenciado pelo envelhecimento do animal. Sendo assim, o presente estudo objetivou estudar a expressão de subunidades P2X em células de Leydig durante os estágios da maturação sexual do camundongo e investigar a formação de receptores heteroméricos P2X2/4/6. A análise semi-quantitativa de RNA mensageiro (mRNA) em camundongos Suíços mostrou que os mRNA das subunidades P2X2 e P2X4 são expressos em todas as idades e estão aumentados nas células imaturas/adultas, e mesenquimais/adultas, respectivamente. O mRNA da subunidade P2X6 é expresso a partir de 21 após o nascimento (pnd) e mostra-se aumentado nas células imaturas/adultas. As subunidades P2X1, P2X3 e P2X5 não apresentam mRNA nas células mesenquimais e seu mRNA está mais expresso nas células progenitoras/adultas, imaturas/adultas, e adultas, respectivamente. A subunidade P2X7 apresenta seu mRNA expresso em todas as idades menos aos 07 pnd e a menor expressão ocorre aos 28 pnd pnd. As proteínas correspondentes às subunidades P2X2, P2X3, P2X4, P2X6 e P2X7 estão presentes em todas as idades avaliadas e variam durante o envelhecimento do camundongo. Não há marcação para a subunidade P2X5 em nenhuma das idades avaliadas. As características dos transientes de cálcio de células de Leydig de camundongos com 14, 24, 35, 60 e 100 pnd estimuladas com ATP ou αβMeATP variam, indicando que a expressão de receptores P2X funcionais também se altera durante a maturação sexual do camundongo, possivelmente por consequência das alterações na expressão das subunidades. Experimentos de lmunofluorescência mostraram que há co-expressão das subunidades P2X2/P2X4, P2X4/P2X7 e P2X2/P2X4/P2X6. Além disso, esses três grupos de subunidades foram co-imunoprecipitadas entre si quando co-expressas em células tsA201. Através de experimentos de Ligação Cruzada observou-se que a interação entre as subunidades P2X2/P2X4 e P2X4/P2X7 ocorre preferencialmente na forma de receptores homoméricos. Imagens de Microscopia de Força Atômica mostraram que o arranjo formado entre as subunidades P2X2/P2X4, P2X4/P2X7 é uma dimerização de receptores trímeros. Além disso, mostraram que as subunidades P2X2/P2X4/P2X6 formam um único receptor heteromérico, evidenciado pela decoração dupla das subunidades com anticorpo e fragmento Fab de anticorpo. Concluímos que a expressão de subunidades P2X em células de Leydig varia durante o envelhecimento do camundongo, sugerindo que esses receptores podem participar da modulação da secreção de Testosterona. Concluímos também que as subunidades P2X2/P2X4 e P2X4/P2X7 interagem, na forma de dímeros de receptores homoméricos. Por último, concluímos que e as subunidades P2X2, P2X4 e P2X6 interagem em conjunto, na forma de um receptor heteromérico ainda não descrito P2X2/4/6.