Avaliação da toxicidade e eficácia de ingredientes de uso tópico por métodos alternativos in vitro: culturas 2D, 3D e microfluídica de orgãos-em-chip

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Tavares, Renata Spagolla Napoleão
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Alternative methods; Citotoxicidade; Cytotoxicity; Esferoide de fígado; Fototoxicidade; Human skin model; In vitro; Irritação; Irritation; Liver spheroid; Métodos alternativos in vitro; Microfluídica; Microfluidics; Modelo de pele humana; Órgãos em chip; Two organs-on-a-chip
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-21092021-055327/

Os ensaios in vitro são aceitos como alternativos à experimentação animal, apenas se apresentarem alta reprodutibilidade e relevância para predizer a toxicidade em seres humanos. Assim, novas tecnologias, tais como tecidos tridimensionais (3D) foram desenvolvidas para preencher a lacuna entre os modelos in vitro bidimensionais (2D) e melhorar a correlação com os humanos. Mais recentemente, os sistemas microfluídicos órgãos-em-chip, que emulam a fisiologia do ambiente in vivo por permitirem a inclusão de diferentes organoides em um mesmo meio circulante, possuem maior potencial preditivo em relação à toxicidade humana e podem ser utilizadas durante a triagem de substâncias desconhecidas. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver e comparar a capacidade de sistemas in vitro de diferentes complexidades: culturas 2D, pele 3D cultivada de modo estático ou em microfluídica associada ao modelo de fígado, em predizer a toxicidade e eficácia das substâncias teste. Para tal, foi desenvolvido um modelo de pele - Reconstructed Human Skin (RHS). Na primeira abordagem, o modelo RHS foi aplicado para a avaliação da fototoxicidade e da atividade antioxidante da fucoxantina, isolada de alga antártica e com um conhecido potencial antioxidante nunca testado na pele humana. A fucoxantina se mostrou fototóxica em monocamadas e fotoinstável, porém quando adicionada em fotoprotetor se mostrou fotoestável. A fucoxantina não foi considerada fototóxica em modelo de pele, demonstrando a importância da presença do estrato córneo para confirmar a toxicidade de compostos desconhecidos. Ainda, se mostrou capaz de inibir as espécies reativas do oxigênio (ERO) de maneira significativa tanto em monocamadas quanto em modelo de pele, mostrando que mesmo em baixas concentrações, exerce efeito protetor contra ERO gerados pela radiação UVA. A etapa seguinte, o RHS foi miniaturizado para adequação em sistema de órgãos-em-chip e o RHS reduzido foi utilizado no ensaio de irritação cutânea da fucoxantina (OECD TG 439). Novas análises foram incluídas em paralelo para a identificação de novos biomarcadores da irritação nos tecidos; o controle positivo lauril sulfato de sódio (LSS) foi considerado irritante e a fucoxantina não; entretanto, a fucoxantina reduziu a expressão de gênica de interleucinas pró-inflamatórias (IL-6 e IL-8) quando no veículo etanol, e aumentou a expressão de NAT1, indicando sua metabolização pela pele e efeito protetor aos efeitos deletérios do etanol. Na terceira abordagem, ensaio de irritação cutânea do RHS reduzido foi avaliado tanto em cultivo estático, quanto dinâmico, para tal, o fármaco de escolha foi o antifúngico terbinafina, por se acumular na pele humana e ter potencial hepatotóxico em terapias de longo prazo. No modelo dinâmico, o RHS foi associado a modelo de fígado e o sistema foi chamado de Chip2. Tanto no RHS estático quanto no Chip2 a terbinafina não foi considerada irritante enquanto que o controle positivo LSS foi o único considerado irritante, por meio dos resultados metabólicos, de liberação de IL-6 e ainda pela análise de viabilidade celular por LDH e MTT (nos tecidos estáticos). Demonstrou também efeitos deletérios nos esferoides de fígado, mostrando ter atravessado o modelo de RHS. Entretanto, no RHS a concentração tópica de terbinafina a 5% no Chip2 aumentou a expressão de IL-1α e ainda aumentou células apoptóticas e diminuiu as proliferativas nos esferoides de fígado, aumentando também a expressão das enzimas hepáticas CYP1A2 e CYP3A4, o que prova que também atravessou o RHS para exercer os efeitos ii observados no fígado. A aplicação sistêmica de 0,1% de terbinafina aumentou a expressão de EGFR apenas no RHS do Chip2 e aumentou as células apoptóticas no fígado, além de regular negativamente a albumina e regular positivamente CYP2C9, agindo como um controle hepatotóxico de terbinafina. A combinação de RHS e fígado no Chip2 em microfluídica permitiu uma resposta mais sensível do RHS observado apenas pela expressão gênica e permitiu a avaliação de efeitos hepáticos causados pelas substâncias capazes de atravessar o RHS. Em conclusão, o aumento da complexidade dos ensaios in vitro desenvolvidos no presente trabalho abrem novas perspectivas para a avaliação da toxicidade e da eficácia de substâncias teste, com o potencial para melhorar a predição dos estudos pré-clínicos.